[发明专利]一株表达猪圆环病毒3型Cap基因的重组植物乳酸菌的制备方法

摘要

本发明涉及生物医药工程技术领域，且公开了一株表达猪圆环病毒3型Cap基因的重组植物乳酸菌的制备方法，包括以下步骤：S1:引物设计及合成，根据GenBank中PCV3基因序列(登录号：AYM55798.1)，利用Primer5.0软件设计引物LpS‑F和LpS‑R用于扩增PCV3 Cap基因序列，片段长度为789bp。该表达猪圆环病毒3型Cap基因的重组植物乳酸菌的制备方法，通过本发明选用植物乳杆菌表达含1320信号肽和DCpep优化的PCV3 Cap基因，选择乳球菌NZ3900作为克隆中间宿主，获得高含量的重组质粒；再使用植物乳杆菌Lp12表达PCV3 Cap蛋白，建立有效的制备及鉴定方法，优化检测手段，为开发3型猪圆环病毒口服候选疫苗奠定理论基础，本发明建立了重组表达PCV3 Cap蛋白的植物乳杆菌，丰富了植物乳杆菌表达异源蛋白的可行性。

主权项

1.一株表达猪圆环病毒3型Cap基因的重组植物乳酸菌的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：S1:引物设计及合成，根据GenBank中PCV3基因序列(登录号：AYM55798.1)，利用Primer5.0软件设计引物LpS‑F和LpS‑R用于扩增PCV3 Cap基因序列，片段长度为789bp；S2：PCV3D基因扩增，以本实验保存的pGH‑PCV3D质粒为模板，进行PCR；S3：重组乳杆菌表达质粒的构建及鉴定，采用无缝克隆技术将S2中的胶回收产物连接到pSIP411载体中，电转化到乳球菌NZ3900中，涂布于含红霉素(浓度为20ug/mL)的M17固体平板上，30℃培养过夜；挑取单个菌落经PCR检测，验证正确后送至公司测序，重组表达质粒再次电转入植物乳杆菌Lp12，涂布于含红霉素(浓度为20ug/mL)的MRS固体平板上，37℃培养过夜；挑取单个菌落，用SF01和SR01通用引物进行克隆PCR鉴定；S4：重组乳杆菌的诱导表达，挑取转化后的阳性重组植物乳杆菌Lp12：pSIP411‑PCV3D及植物乳杆菌Lp12分别1％接种于新鲜MRS液体培养基(红霉素浓度为20ug/mL)，37℃静置培养过夜，当OD值为0.3‑0.5时，添加诱导肽SppIP(浓度为50ng/mL),继续培养6h，4000rpm离心收集重组植物乳杆菌，重组植物乳杆菌用等量PBS冲洗3遍去除MRS培养基，再用等量PBS重悬，使用等量玻璃珠研磨机研磨，收集蛋白液体，‑80℃保存备用；S5：重组乳杆菌表达产物的鉴定,将制作好的重组乳杆菌表达的蛋白液体取适量，加入5xSDS‑PAGE Loading Buffer混合均匀，沸水煮5‑8min。12％SDS‑PAGE电泳后，通过半干式转膜转印PVDF膜上用于Western Blot分析：5％的脱脂乳室温震荡封闭2h，PBST洗3次；1:5000兔源Anti‑HA标签抗体4℃过夜孵育，PBST洗5次；HRP标记的羊抗兔二抗孵育1h，PBST洗5次；ECL显影观察并拍照；S6：外源基因表达的间接免疫荧光验证，1％重组植物乳杆菌接种于液体MRS培养基中(红霉素浓度为20ug/mL)，培养6h后收集菌体用等量PBS洗3遍。一抗用含1:5000的兔源Anti‑HA标签抗体孵育过夜，PBS清洗3遍，FITC标记的二抗1：5000孵育2h，PBS清洗4遍，进行制片，油镜下观察外源基因的表达情况。S7：外源基因表达的流式细胞分析，1％重组植物乳杆菌接种于液体MRS培养基中(红霉素浓度为20ug/mL)，培养6h后收集菌体用等量PBS洗3遍，一抗用含1:5000的兔源Anti‑HA标签抗体孵育过夜，PBS清洗3遍，FITC标记的二抗1:5000孵育2h，PBS清洗4遍，取适量菌体用于流式细胞仪进行分析。