[发明专利]基于CRISPR/Cas9系统在Beta-TC-6细胞株中剔除Sidt2基因方法

摘要

本发明公开了基于CRISPR/Cas9系统在Beta‑TC‑6细胞株中剔除Sidt2基因方法，针对小鼠胰岛素瘤胰岛β细胞(Beta‑TC‑6)难转染以及CRISPR/Cas9质粒分子较大的特点，通过采取电穿孔进行Cas9质粒的递送，并设置不同的穿孔电压梯度进行电转参数的优化，从而实现了在小鼠胰岛素瘤胰岛β细胞(Beta‑TC‑6)中高效的递送CRISPR/Cas9质粒；同时，通过将CRISPR/Cas9基因编辑系统和电穿孔相结合，克服了CRISPR/Cas9质粒难转导的特点，为常规的分子生物学实验室开展CRISPR/Cas9基因基因编辑系统提供了切实可行的办法，具有极高的推广应用价值。

主权项

1.基于CRISPR/Cas9系统在Beta‑TC‑6细胞株中剔除Sidt2基因方法，具体实验步骤如下：(1)、sgRNA oligo DNA序列合成；利用sgRNA在线设计工具针对小鼠Sidt2基因设计长度为20bp左右的oligo DNA，sgRNAssDNA序列F链5’端需要添加CACC从而可以和BbsI酶切后的载体互补，需要注意的是F链的第一个碱基必须是G，如果选取的Guide序列的第一个碱基不是G，可自行添加一个G以增强U6启动子的活性，R链的5’端添加AAAC。另外，需在位点上下游各设计一条引物，用于后续检测阳性克隆，引物能扩增约300bp的DNA片段，上游引物距突变位点约100bp，下游引物距突变位点约200bp。将设计后的序列进行合成，纯化级别为PAGE；(2)、oligo DNA退火：合成的sgRNA稀释为终浓度为100uM，配制退火反应体系：稀释的sgRNA各1ul，2ulAnnealing Buffer for DNA Oligos(5X)，用超纯水补足到10ul。PCR仪中95℃10分钟，随后取出室温冷却两个小时。稀释10倍后储存在‑20℃备用；(3)、px459重组质粒的构建：px459质粒为含有U6启动子的sgRNA骨架的表达载体。(A)px459载体的线性化：使用BbsI限制性内切酶线性化px459载体，使用胶回收试剂盒回收线性化px459载体。(B)sgRNA与线性化px459连接：按照T4连接酶说明书配置反应体系，PCR中25℃反应3小时。(C)连接产物转化感受态细胞DH5α，37℃培养过夜。次日挑取菌落摇菌抽提质粒；(5)、px459重组质粒的验证：质粒送生物公司测序，测序引物为U6启动子通用引物，根据测序结果鉴定sgRNA是否正确连接到载体中。测序成功的质粒命名为px459‑Sidt2，使用去内毒素质粒大量提取试剂盒抽提质粒，要求质粒浓度大于1ug/ul并且纯度达到电转染要求；(6)、Beta‑TC‑6细胞的培养：细胞培养条件为含15％胎牛血清的DMEM高糖培养基，细胞汇合度达到70％左右进行传代；(7)、px459‑Sidt2质粒的电转：电转前细胞融合度达到80％左右，胰酶消化细胞后加入Opti‑MEM使其成为单细胞悬液并且调整细胞数量为1x106个/90ul，吸取90ul细胞悬液加入10ul质粒轻轻混匀后加入电转杯中。设置导入电转参数：脉冲电压为20V，脉冲时间为20ms，脉冲间隔为50ms，脉冲次数为5次，电压衰减为40％，电穿孔模式为正方向。穿孔电转参数为：固定脉冲时间5ms，脉冲间隔50ms，脉冲次数2次，电压衰减10％，电穿孔模式为正方向，设置脉冲电压梯度为125V、150v、175v、200v。完成电转染的细胞在六孔板中培养过夜；(8)、阳性细胞的筛选：电转染48小时加入嘌呤霉素至终浓度为3ug/ml进行筛选(提前需要进行嘌呤霉素筛选梯度的摸索，本实验室小鼠胰岛素瘤胰岛β细胞Beta‑TC‑6的筛选浓度为3ug/ml)，72小时后换为正常培养条件，扩增冻存；(9)、T7酶和Western blot检测：野生型细胞以及阳性细胞一部分使用试剂盒提取DNA，一部分使用细胞裂解液提取全细胞蛋白。提取的DNA通过PCR对sgRNA的靶向区域进行扩增，扩增引物的退火温度54℃。(1)T7酶切分析：按照说明书进行操作，酶切后的产物通过2％琼脂糖凝胶分析。(2)Western blot检测：使用微量分光光度计测定蛋白浓度，取等量的蛋白加入蛋白上样缓冲液，煮沸后进行SDS‑PAGE电泳，电泳完成后湿转到PVDF上，用5％的脱脂奶粉封闭一个小时，一抗孵育过夜，第二天进行二抗孵育，加入曝光底物后使用超灵敏多功能成像仪进行曝光，以β‑actin作为内参；(10)、px459‑Sidt2克隆构建：px459空载体经BbsI酶切线性化后，从琼脂糖凝胶中回收酶切后的线性化片段。将退火的sgRNA双链和回收的线性化px459载体相连，构建px459‑Sidt2重组质粒。构建的px459‑Sidt2经测序表明插入序列的位置、方向均正确，重组质粒px459‑Sidt2构建成功；(11)、T7E1酶及Western blot检测小鼠Sidt2基因的敲除效果：T7E1酶结果显示，电转染px459‑Sidt2的混合克隆细胞有一条明显的切开的条带，即混合克隆细胞中出现碱基错配，表明px459‑Sidt2在Beta‑TC‑6细胞中实现靶向敲除。Western blot检测敲除效果，结果显示同野生型细胞比较，混合克隆细胞Sidt2蛋白表达显著降低(t＝6.668，P＝0.0026)。进一步实验需要进行单克隆培养，从而得到敲除效率为100％的克隆细胞株。