[发明专利]一种外源蛋白原核分泌表达系统及其应用

摘要

本发明提供一种外源蛋白原核分泌表达系统及其应用，能够以胞外分泌的方式大量生产外源目的蛋白，且易于纯化、操作简便，具有较高的推广和应用价值。

主权项

1.一种外源蛋白原核分泌表达系统，其特征在于，包括工程菌和基因原核表达载体，其中该工程菌为布鲁氏菌单胞菌，该基因原核表达载体为BMEI0742基因原核表达载体；根据GenBank中登录的布鲁氏菌(NC－003317)BMEI0742基因序列设计引物，序列为5'→3'；PCR引物为上游同源臂的上游引物UP‑F和下游同源臂的下游引物DOWN‑R，模板为上、下游同源臂纯化产物；以布鲁氏菌16M株的灭活菌液为样本，进行菌液PCR扩增，PCR反应体系反应条件为:90℃5min；88℃40s，60℃45s，70℃1min，40个循环；最后70℃1min；反应结束后，PCR产物4℃保存或直接进行1％琼脂糖凝胶凝胶电泳；回收目的基因片段，并将回收后目的基因片段与pMD19－T载体在16℃水浴条件下进行连接，构建重组质粒pMD19－T－BMEI0742；其中，PCR反应体系组份为：2×Es Taq Master mix，共10.0μL，上游引物0.2μL，下游引物0.2μL，模板2μL，去离子水7.6μL；连接体系组份为：目的基因6.5μL，pMD19－T载体0.5μL，T4 DNA ligase Buffer 2.0μL，T4 DNA ligase 1.0μL；重组质粒转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞，并在氨苄抗性的LB固体培养基上进行阳性筛选，进行菌液PCR和双酶切鉴定阳性克隆；并将提取的质粒进行测序后正确的质粒pMD19－T－BMEI0742和pET－28a载体用限制性内切酶BamHⅠ和XhoⅠ进行双酶切，经琼脂糖凝胶回收试剂盒回收目的片段和酶切后的线性pET－28a载体；将目的片段和线性pET－28a载体在T4连接酶的作用下16℃水浴连接，连接产物转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞；经卡那抗性的LB固体培养基筛选阳性克隆，进行菌液PCR验证和酶切鉴定；将筛选出的阳性克隆菌在LB液体培养基中，37℃，200r/min摇床中培养过夜，将培养过夜的菌液按1∶100的比例接种至新鲜的LB液体培养基中，于37℃、200r/min条件下培养约1h，使其D600nm值为0.4～0.6，在其他条件不变的情况下，按照不同的诱导剂(IPTG)浓度(终浓度为0.2、0.6、1.0mmol/L)诱导不同时间(0、4、6、8h)后收集菌体；取1mL菌液离心后，弃掉上清，并在离心管中按照1∶4的比例加入经过稀释的1×SDS蛋白上样缓冲液，在振荡器上振荡使菌体和蛋白上样液充分混匀，在金属加热器上100℃加热10min，取20μL样品进行15％蛋白电泳，观察电泳结果；筛选目的基因的最佳表达条件，并以最佳的诱导表达条件进行大量诱导表达，采用AKTA蛋白纯化系统纯化后进行SDS－PAGE电泳鉴定。