[发明专利]一种胶原蛋白-氧化石墨烯-脂肪脱细胞基质微载体的制备方法

摘要

本发明提供一种胶原蛋白‑氧化石墨烯‑脂肪脱细胞基质微载体的制备方法。其方法具体如下：取人脂肪组织反复冻融后乳化得到脂肪，并离心去除上层油和下层水，取中间层采用生理盐水、胰蛋白酶‑EDTA消化液、异丙醇、混合酶溶液进行脱细胞处理，再用α‑淀粉酶水溶液和醋酸匀浆得到脂肪脱细胞基质溶液，并与胶原蛋白‑氧化石墨烯溶液混合作为分散相通入微流控芯片，将含有span‑80的正癸醇作为连续相通入微流控芯片，获得包裹有正癸醇的脱细胞基质‑胶原蛋白‑氧化石墨烯液滴，并通过交联液交联得到所述微载体。本发明能够生产成分均一的脱细胞基质微载体，得到的微载体更利于细胞生长，可用于脂肪干细胞培养。

主权项

1.一种胶原蛋白‑氧化石墨烯‑脂肪脱细胞基质微载体的制备方法，其特征在于具体步骤如下：(1)脂肪脱细胞基质制备：a.取人脂肪组织置于‑80℃条件下冰冻20～40分钟，然后取出，在室温下静置至完全解冻，如此反复冻融3～5个循环；b.将步骤a中反复冻融后的脂肪离心后去除最上层油和最下层水，取中间一层并加入生理盐水洗涤后离心后去除缓冲液，用胰蛋白酶‑EDTA消化液在37℃下浸泡16～24h后离心去除消化液，再加入异丙醇在37℃下浸泡48～60h后离心去除异丙醇，最后用生理盐水重复洗涤3～5次，每次加入生理盐水混匀洗涤后离心去除缓冲液；c.将步骤b中浸泡洗涤后的脂肪加入混合酶溶液在37℃下浸泡16～24h后离心去除混合酶溶液，并加入生理盐水重复洗涤3～5次，每次加入生理盐水混匀洗涤并离心去除缓冲液；其中所述混合酶溶是由以下比例的物质配制而成：55mmol/L Na₂HPO4、17mmol/L KH₂PO4、4.9mmol/L MgSO₄·7H₂O、15000U DNase、12.5mg Rnase、2000UII型脂肪酶；d.将步骤c中混合酶浸泡洗涤后的脂肪再次加入异丙醇在37℃下浸泡6～10h后离心去除异丙醇，最后采用生理盐水混匀洗涤后离心去除缓冲液得到脂肪脱细胞基质；(2)脂肪脱细胞基质溶液制备：将步骤(1)中制备的脂肪脱细胞基质采用重量体积比为0.3％的α‑淀粉酶水溶液浸泡70～75h后，离心去除α‑淀粉酶水溶液，再将脱细胞基质放入浓度为0.2mol/L的醋酸溶液中，并匀浆，使脱细胞基质质量体积为0.1％～3％，得到脂肪脱细胞基质溶液；(3)制作毛细管微流控芯片：将内径100～400um和500～1000um的玻璃毛细管嵌套0.5～5cm，并将嵌套后的两根玻璃毛细管固定在载玻片上，其固定后内层毛细管两端及外层毛细管与内层毛细管嵌套一端均置于载玻片上，外层毛细管未嵌套一端伸出载玻片，并在内层毛细管未嵌套端以及外层毛细管与内层毛细管嵌套端分别倒扣加样枪枪头，加样枪头底部边缘与载玻片密封连接，且连接后其两个加样枪枪头倒扣区域分别形成一个与内层毛细管连通的第一密封腔和一个与外层毛细管连通的第二密封腔，制成微流控芯片；(4)制备胶原蛋白‑氧化石墨烯溶液：将胶原蛋白和氧化石墨烯加入0.1mol/L的醋酸溶液中配制含有浓度1％w/v～4％w/v胶原蛋白、0.01～0.4％w/v氧化石墨烯的混合溶液，用超声细胞破碎器以30％强度、超声时间1～3s、间歇时间1～3s进行超声混匀，得到均匀的胶原蛋白‑氧化石墨烯溶液；(5)将步骤(2)中的制备的脱细胞基质溶液与步骤(4)中配制的胶原蛋白‑氧化石墨烯溶液按1:1～1:10的比例混合置于注射器中，用软管连接到微流控芯片上与内层毛细管相连的枪头开口端；将span‑80与纯正癸醇混合后的溶液，其中span‑80的质量体积比为5％，置于注射器中，用软管连接到微流控芯片上与外层毛细管相连的枪头开口端；并调节流速使得脱细胞基质‑胶原蛋白‑氧化石墨烯混合溶液与正癸醇溶液流速比为1:1～1:20，获得包裹有正癸醇的脱细胞基质‑胶原蛋白‑氧化石墨烯液滴；(6)将NaCl₂、EDC、NHS、Tween20加入0.05mol/L的Tris‑HCl(pH 8.0)的溶液中，配制NaCl₂的质量体积比为5％，EDC浓度为5mg/ml，NHS的浓度为2mg/ml，Tween20的体积分数为5％的交联液；将步骤(4)中获得的包裹有正癸醇的脱细胞基质‑胶原蛋白‑氧化石墨烯液滴通入上述交联液中静置16～24h后，去除溶液收集微载体，并洗涤后得到胶原蛋白‑氧化石墨烯‑脂肪脱细胞基质微载体。