[发明专利]一种抑制石斑鱼病原弧菌的药物先导化合物筛选方法

摘要

本发明属于药物筛选领域，公开了一种抑制石斑鱼病原弧菌的药物先导化合物筛选方法，所述抑制石斑鱼病原弧菌的药物先导化合物筛选方法为：采用紫海胆的放线菌利用分菌技术进行分离，利用培养技术和萃取技术得发酵液浸膏，通过活性筛选和结构新颖性筛选有价值的放线菌，对放线菌进行小规模发酵、提取浸膏，对提取的化合物进行分离，并进行结构鉴定，活性确认。本发明首次对海南南海紫海胆肠道放线菌的活性次级代谢产物进行检测与筛选，首次利用海洋生物肠道放线菌发酵产物筛选抗石斑鱼病原弧菌活性的活性分子，从中筛选出抑制石斑鱼病原弧菌的药物先导化合物。

主权项

1.一种抑制石斑鱼病原弧菌的药物先导化合物筛选方法，其特征在于，所述抑制石斑鱼病原弧菌的药物先导化合物筛选方法为：步骤一：将采用无菌陈海水冲，75％酒精消毒及用无菌水洗3遍后的紫海胆，取其肠道组织置于无菌水中，稀释，吸取200μL，涂在含有50μg/mL重铬酸钾和20μg/mL卡那霉素的高氏培养基平板上，在28℃下培养15天，挑取单菌落划线接种至ISP2培养基平板上，经3次单菌落划线纯化即得到放线菌菌株；步骤二：利用液体高氏培养基和麦芽提取物培养基小规模发酵所纯化的放线菌，过滤发酵液得到菌液和菌体，将菌液浓缩后用乙酸乙酯提取，菌体用氯仿甲醇，体积比为1:1浸提，浓缩后得到的提取物供抗病原菌活性筛选；步骤三：采用平板滤纸片法筛选出2株菌株发酵液的乙酸乙酯粗提物对石斑鱼溶藻弧菌菌株具有生长抑制活性，抑菌圈直径为8–17mm；步骤四：利用上述培养基并通过优化培养条件和添加诱导物小规模发酵上述2株活性菌株，过滤除去菌体，用乙酸乙酯萃取发酵液，得粗提物，并进行活性筛选，并对诱导后的菌株产生的新次级代谢产物进行检测；步骤五：分别利用筛选培养基和添加诱导物的培养基对2株放线菌在优化好的培养条件下进行大规模发酵，发酵液与菌丝体分别以乙酸乙酯、等体积的氯仿甲醇萃取3遍，然后在抗菌活性筛选指导下，采用多种色谱分离技术将活性成分从发酵液和菌体粗提物中分离精制出来；步骤六：综合运用现代波谱技术确定单体化合物的化学结构及空间立体化学结构；步骤七：用平板滤纸片法对上述结构确定的活性化合物进行抗石斑鱼病原弧菌活性评价，排除假阳性可能和其他干扰，以得到真正的抗菌、抗病新活性物质；步骤八：对以上活性确定的化合物，采用化学或生物合成的方法进行结构修饰、制备系列衍生物，再进行活性评价，确定其构效关系，筛选出活性更强、毒性更低的防治石斑鱼弧菌病害药物的生物源天然药物先导化合物。