[发明专利]一种甘蔗梢腐病病原菌原生质体制备与再生的方法

摘要

本发明公开了一种甘蔗梢腐病病原菌原生质体制备与再生的方法，该方法具体操作步骤如下：(1)甘蔗梢腐病病原菌孢悬液的制备；(2)新鲜菌丝体的制备；(3)溶壁酶的配置；(4)菌丝细胞壁的酶解；(5)原生质体收集；(6)原生质体再生；(7)再生情况的调查。本发明成本低，操作简单，对设备要求低，同时酶解时间及再生周期短，大大提高了甘蔗梢腐病病原菌原生质体的制备效率，较好的保持了原生质体活性，具有较强的再生能力，有利于后续病原菌的遗传转化和转化子的筛选。

主权项

1.一种甘蔗梢腐病病原菌原生质体制备与再生的方法，其特征在于：包括如下步骤，(1)甘蔗梢腐病病原菌孢悬液的制备：将病原菌接种于马铃薯葡萄糖琼脂PDA培养基中活化，然后挑取菌落边缘的菌丝接种于马铃薯葡萄糖水PDW培养基中，于恒温摇床中培养，离心法收集菌体，无菌水配制成孢悬液；(2)新鲜菌丝体的制备：取配制好的孢悬液1ml接种于100ml马铃薯葡萄糖水PDW培养基中，恒温摇床中培养，经灭菌擦镜纸过滤获取新鲜菌丝体，用预冷0.8mol/L NaCl溶液充分洗涤；(3)溶壁酶的配置：称取100mg溶壁酶，用预冷0.8mol/L NaCl溶液配制成10mg/ml酶液，经微孔滤膜过滤除菌后备用；(4)菌丝细胞壁的酶解：取0.5g新鲜菌丝体，加入10ml溶壁酶，于恒温摇床中培养，期间每半小时进行显微镜检查一次；(5)原生质体收集：用灭菌擦镜纸过滤步骤(4)的酶解液以除去未被酶解的菌丝残体，用预冷0.8mol/L NaCl溶液洗涤滤液，离心分离，弃上清液，用山梨醇溶液STC溶解沉淀，并在光学显微镜下计数，调节原生质体浓度为1×107个/ml，分装于1.5ml离心管中，于‑80℃冰箱中保存备用；(6)原生质体再生：取制备好的原生质体悬浮液用0.8mol/L蔗糖溶液稀释100倍，用直接涂布法，吸取200μl原生质体稀释液涂布于再生培养基上，放置于恒温培养箱中培养；同时取等体积的原生质体悬浮液用无菌水稀释，吸取200μl原生质体稀释液涂布于马铃薯葡萄糖琼脂PDA培养基上，作为对照；(7)再生情况的调查：设再生培养基上长出的菌落数为A，对照菌落数为B，则原生质体再生率＝(A‑B)×100/原生质体总数×100％。