[发明专利]一种甘蔗梢腐病病原菌原生质体制备与再生的方法

权利要求书

1.一种甘蔗梢腐病病原菌原生质体制备与再生的方法，其特征在于：包括如下步骤，

(1)甘蔗梢腐病病原菌孢悬液的制备：将病原菌接种于马铃薯葡萄糖琼脂PDA培养基中活化，然后挑取菌落边缘的菌丝接种于马铃薯葡萄糖水PDW培养基中，于恒温摇床中培养，离心法收集菌体，无菌水配制成孢悬液；

(2)新鲜菌丝体的制备：取配制好的孢悬液1ml接种于100ml马铃薯葡萄糖水PDW培养基中，恒温摇床中培养，经灭菌擦镜纸过滤获取新鲜菌丝体，用预冷0.8mol/L NaCl溶液充分洗涤；

(3)溶壁酶的配置：称取100mg溶壁酶，用预冷0.8mol/L NaCl溶液配制成10mg/ml酶液，经微孔滤膜过滤除菌后备用；

(4)菌丝细胞壁的酶解：取0.5g新鲜菌丝体，加入10ml溶壁酶，于恒温摇床中培养，期间每半小时进行显微镜检查一次；

(5)原生质体收集：用灭菌擦镜纸过滤步骤(4)的酶解液以除去未被酶解的菌丝残体，用预冷0.8mol/L NaCl溶液洗涤滤液，离心分离，弃上清液，用山梨醇溶液STC溶解沉淀，并在光学显微镜下计数，调节原生质体浓度为1×10⁷个/ml，分装于1.5ml离心管中，于-80℃冰箱中保存备用；

(6)原生质体再生：取制备好的原生质体悬浮液用0.8mol/L蔗糖溶液稀释100倍，用直接涂布法，吸取200μl原生质体稀释液涂布于再生培养基上，放置于恒温培养箱中培养；同时取等体积的原生质体悬浮液用无菌水稀释，吸取200μl原生质体稀释液涂布于马铃薯葡萄糖琼脂PDA培养基上，作为对照；

(7)再生情况的调查：设再生培养基上长出的菌落数为A，对照菌落数为B，则原生质体再生率＝(A-B)×100/原生质体总数×100％。

2.根据权利要求1所述的甘蔗梢腐病病原菌原生质体制备与再生的方法，其特征在于：所述马铃薯葡萄糖琼脂PDA培养基、马铃薯葡萄糖水PDW培养基、再生培养基和蔗糖溶液经过121℃高压灭菌20min后使用；所述马铃薯葡萄糖琼脂PDA培养基、马铃薯葡萄糖水PDW培养基、再生培养基中含100μg/ml氨苄青霉素。

3.根据权利要求1所述的甘蔗梢腐病病原菌原生质体制备与再生的方法，其特征在于：所述步骤(1)将病原菌接种于马铃薯葡萄糖琼脂PDA培养基中活化3-4d，然后挑取菌落边缘的菌丝接种于100ml马铃薯葡萄糖水PDW培养基中，于转速为220rpm，温度为28℃的恒温摇床中培养3～4d。

4.根据权利要求1所述的甘蔗梢腐病病原菌原生质体制备与再生的方法，其特征在于：所述步骤(2)中接种孢悬液后的马铃薯葡萄糖水PDW培养基在转速为220rpm，温度为28℃的恒温摇床中培养的时间为18-20h。

5.根据权利要求1所述的甘蔗梢腐病病原菌原生质体制备与再生的方法，其特征在于：所述0.8mol/L NaCl溶液用0.1mol/L PH 5.5-6.0的磷酸缓冲液溶解NaCl配制而成，于121℃高压灭菌20min后，放置于4℃冰箱中进行预冷，保存备用。

6.根据权利要求1所述的甘蔗梢腐病病原菌原生质体制备与再生的方法，其特征在于：所述步骤(4)中新鲜菌丝体加入溶壁酶后在转速为80rpm，温度为28℃的恒温摇床中培养的时间为3-4h。

7.根据权利要求1所述的甘蔗梢腐病病原菌原生质体制备与再生的方法，其特征在于：所述步骤(5)中离心分离的时间为10min，转速为5000rpm。

8.根据权利要求1所述的甘蔗梢腐病病原菌原生质体制备与再生的方法，其特征在于：所述步骤(5)中山梨醇溶液STC的配制方法为：先配置好pH为7.5，浓度为的10mmol/L的Tris-HCl，再添加山梨醇和CaCl₂，使山梨醇浓度为1.2mol/L、CaCl₂浓度为10mmol/L；配置好的山梨醇溶液STC于121℃高压灭菌20min后，放置于4℃冰箱中保存备用。