[发明专利]一种基于生物条形码的microRNA-7a电化学检测方法及应用

摘要

本发明公开了一种基于生物条形码的microRNA‑7a电化学检测方法及应用。首先利用磁珠标记链霉亲和素修饰的捕获探针形成MB‑CP1结构，金纳米标记巯基修饰的信号探针和条形码形成Au‑RP1‑barcode结构。在目标物的存在下，MB‑CP1,Au‑RP1分别与目标物两端互补，形成“三明治”结构，利用二硫苏糖醇释放金纳米上面的条形码。生物传感器由连接在金电极上亚甲基蓝修饰的信号探针RP2与捕获探针CP2杂交组成，加入释放的条形码与捕获探针杂交，信号探针中修饰亚甲基蓝的一端与金电极接近，产生了信号电流，从而间接定量检测了目标物。本发明选择性好、灵敏度高、在癌症标记物的检测中有着重要的应用价值。

主权项

1.一种基于生物条形码的microRNA‑7a电化学检测方法，其特征在于具体步骤为：（1）纳米金合成制备：移取100 mL质量百分比浓度为0.01%的氯金酸溶液倒入圆底烧瓶中，将其放置油浴锅中加热煮沸后迅速加入3 mL 质量百分比浓度为1%的柠檬酸钠溶液作为还原剂，继续加热15分钟，观察溶液的颜色从最初的淡黄色逐渐变成酒红色，最后停止加热冷却至室温，并且全程处于搅拌状态下进行，得浓度为5.8 nmol/mL金纳米溶液；纳米金的粒径为16nm；（2）金标记识别信号探针以及条形码即Au‑RP1‑barcode的制备：取2.5μL浓度为10 μmol/L的信号探针RP1与50μL~275μL浓度为10 μmol/L的条形码混合后加入202.5 μL含10 mmol/L 三(2‑羧乙基)膦浓度为10 mmol/L pH 5.8~7.4的磷酸盐缓冲溶液中活化2小时，活化完毕后加入0.5 mL步骤（1）所得的浓度为5.8 nmol/mL金纳米溶液，立即震荡均匀并迅速裹上锡纸避光孵育16小时；接着加入9.1 μL质量百分比浓度为10% 的十二烷基硫酸钠溶液，使最终质量百分比浓度为0.1 %；再加入101.6μL浓度为0.1mol/L pH 7.4 磷酸盐缓冲溶液，使其最终浓度为10 mmol/L；再加入53.5μL浓度为2 mol/L 的NaCl溶液，使其最终浓度为0.1mol/L；在孵育24小时后使用高速离心机离心，10000 转/分钟，20分钟，分散至含0.1 mol/L NaCl浓度为10 mmol/L pH 7.4磷酸盐缓冲溶液中并重复清洗3次，去掉上清液，最后分散0.5 mL至含0.1 mol/L NaCl浓度为10 mmol/L pH 7.4 磷酸盐缓冲溶液中，震荡均匀，放置在4℃的黑暗环境中得Au‑RP1‑barcode溶液；所述的信号探针RP1为巯基修饰的DNA序列，其碱基序列为：5´‑SH‑TTTTTTTTTTTTTTTTTTTAACTATACAAC‑3´；（3）磁珠标记捕获探针即MB‑CP1的制备：量取1 mg磁珠置于离心管中，经过磁性分离，弃去上清液，然后用100 μL TTL缓冲溶液清洗1次，接着分散至200 μL TTL缓冲溶液中，然后往溶液中加入50 μL浓度为10 μmol/L捕获探针CP1，在室温下轻微震荡孵育15分钟，以使生物素修饰的捕获探针CP1与链霉亲和素包被的磁珠MB轻缓而充分地结合，最后使用100μL TT 缓冲溶液清洗2次，磁性分离，弃去上清液，分散至500 μL含0.2mol/L NaCl浓度为10 mmol/L pH 7.4 PBS溶液中得浓度为10mg/mL的MB‑CP1溶液；所述的捕获探针CP1为修饰生物素的DNA序列，其碱基序列为： 5´‑CTACTACCTCATTTTTTTTTTTTTTTTTTTT‑biotin‑3´；所述TTL缓冲溶液包含100 mmol/L Tris‑HCl、pH 8.0，体积百分比浓度为的0.1% Tween® 20以及1mol/L LiCl ；所述TT 缓冲溶液包含250 mmol/L Tris‑HCl、pH 8.0，体积百分比浓度为0.1% Tween® 20；（4）探针杂交以及条形码释放：移取10 μL步骤（2）所得浓度为5.8 nmol/mL Au‑RP1‑barcode溶液、10 μL步骤（3）所得浓度为10mg/mL的MB‑CP1溶液和10 μL浓度范围为1fmol/L~1pmol/L的目标物，震荡混匀后置于PCR仪中在30 ℃下孵育45分钟，磁性分离，用含0.1mol/L NaCl、0.1% 十二烷基硫酸钠10 mmol/L pH 7.4 磷酸盐缓冲溶液，振荡清洗三次后，将收集的磁珠分散至10 uL浓度为 0.5 mol/L的二硫苏糖醇溶液中，在50℃下反应15 分钟，再在25℃下保持45分钟，最后经过磁性分离，取上清液，得条形码，4℃冷藏备用；（5）生物传感器的组装以及目标物检测：取4 μL浓度为10 umol/L 捕获探针CP2与72 uL浓度为10 mmol/L pH 5.8~7.4磷酸盐缓冲溶液混合,然后加入4 uL含10 mmol/L三(2‑羧乙基)膦浓度为10 mmol/L pH 5.8~7.4 磷酸盐缓冲溶液，振荡均匀，室温下活化2小时；在已经处理好的金电极表面滴加10 uL活化后的捕获探针CP2，在室温下孵育反应16小时；用浓度为10 mmol/L pH 5.8 PBS溶液对金电极浸洗3次，除去未连接捕获探针CP2，然后用氮气吹干金电极表面，滴加10 uL含1 mmol/L巯基己醇浓度为10 mmol/L pH 7.4 磷酸盐缓冲溶液，封闭时间为1小时；用浓度为200 mmol/L pH 7.4 磷酸盐缓冲溶液对金电极浸洗3次，除去未连接的巯基乙醇，氮气吹干金电极表面；在金电极表面滴加10 uL浓度为2.5 umol/L的信号探针 RP2，杂交时间为6小时；用含0.1 mol/L NaCl浓度为10 mmol/L pH 7.4 磷酸盐缓冲溶液对金电极进行浸洗3次，用氮气吹干金电极表面；往金电极表面滴加10 uL步骤（4）所得条形码，杂交5 小时；用含0.1 mol/L NaCl浓度为10 mmol/L pH 7.4 磷酸盐缓冲溶液对金电极进行浸洗3次，以除去游离的条形码，用氮气吹干金电极表面；利用三电极体系，以含0.1 mol/L NaCl 10 mmol/L pH 7.4磷酸盐缓冲溶液为电解质，用差分脉冲伏安法对金电极表面的电活性物质亚甲基蓝进行扫描，由此间接得到不同浓度目标物的电化学信号；所述捕获探针CP2 为巯基修饰的DNA序列，其碱基序列为： 5´‑SH‑GCGAGTTAGACCGATCCCCCCCCTTCGTCCAGTCTTTT ‑3´ ;所述信号探针RP2为亚甲基蓝MB修饰的DNA序列，其碱基序列为：5´‑MB‑GACTGGACGCCCCCCCATCGGTCTAACTCGC ‑3´。