[发明专利]一种纳米颗粒的胞吞作用及胞内聚集程度的研究方法

摘要

本发明涉及一种纳米颗粒的胞吞作用及胞内聚集程度的研究方法，包括金纳米颗粒表面单链DNA配体修饰、在盖玻片上进行细胞培养、纳米颗粒的细胞内吞培养，最后通过暗场显微镜观察得到细胞内吞纳米粒子的暗场散射图像，通过图像分析，可以定量纳米颗粒的胞吞过程及由于配体降解导致的不同聚集程度。本发明用DNA作为配体，DNA碱基进行硫代修饰可以抑制细胞内酶对DNA配体的降解作用，进而调控纳米粒子在细胞内的聚集程度。同时，金纳米颗粒局域表面等离子体共振（LSPR）光散射的暗场成像，灵密度高，特异性强，操作简单，对纳米颗粒胞吞过程和聚集程度的研究有着重要的意义。

主权项

1.一种纳米颗粒的胞吞作用及胞内聚集程度的研究方法，其特征是：包括如下步骤：（1）金纳米颗粒表面单链DNA配体修饰：利用柠檬酸还原法制备40nm的金纳米颗粒；采用3'或5'端修饰巯基的单链DNA作为配体（自由伸展，无特殊空间结构），通过Au‑S键合作用修饰金纳米粒子；所述金纳米颗粒表面修饰配体的制备方法，包括以下步骤：DNA样品离心管加水之前，预离心3分钟（5000rpm），防止开盖过程中致使DNA分子溢出；金纳米颗粒与DNA单链浓度的投料比为1:800，混合物室温下避光孵育16‑24小时；样品使用之前离心，除去上清液中未反应的DNA分子，样品分散在含1‑3% FBS（胎牛血清）的无酚红的DMEM培养基中；（2）在盖玻片上进行细胞培养：所述细胞为贴壁细胞，将细胞接种在多个盖玻片上，将所述盖玻片放入培养皿中，采用培养基进行培养；（3）纳米颗粒的细胞内吞作用：移除步骤2）培养皿中的培养基，用无酚红的DMEM培养基洗2‑3次，加入步骤1）制备的分散在培养基中的金纳米颗粒，将培养皿放回CO2培养箱中继续培养12个小时，其间每隔1h从培养皿中取出一个盖玻片，用4%的戊二醛4℃固定6‑8h；（4）通过暗场显微镜观察得到细胞内吞纳米粒子的暗场散射图像，通过图像分析，可以定量纳米颗粒的胞吞过程及由于配体降解导致的不同聚集程度，具体分析方法为：a. 将暗场散射图像由sRGB彩色空间转换成L*A*B彩色空间，将得到的所有L*A*B彩色空间图像的像素进行亮度阈值运算，得到非背景像素和背景像素；b. 得到非背景像素采用八连通的洪泛算法进行分割，然后将非背景像素间距离小于或等于给定距离r的子区域合并为同一子区域，得到多个包含单一连续形状的子图像，对于子图像进行色彩比较算法，得到子图像中的非背景像素与给定的金纳米颗粒的特征色彩值的差值小于给定的色彩容差阈值的非背景像素像素点为金纳米颗粒通道，然后将子图像和金纳米颗粒通道分别转换为子图像二值图像和金纳米颗粒通道二值通道；c. 金纳米颗粒通道二值图像，用八连通的洪泛算法对其中的每一非背景像素进行填充，得到单一金纳米颗粒的图像列表，计算单一金纳米颗粒的图像列表中的每一个连续图形的周长和轴比，去掉所述每一个连续图形的周长小于连续图形周长给定值1或所述每一个连续图形的轴比小于连续图形轴比给定值1的图形，将剩余图形作为金纳米颗粒图像。