[发明专利]牛白血病毒快速检测方法

摘要

本发明涉及一种牛白血病毒快速检测方法，该方法直接以血液作为检测样本，不需要进行特殊处理，便于采集、保存和运输；针对牛白血病病毒（BLV）前病毒最为保守的部分LTR设计引物扩增，保证了本方法的准确性和稳定性；本发明基于巢式PCR检测方法，能快速检测血液样品中牛白血病病毒，其灵敏度可检测到1fg的DNA模板，是一般的PCR检测敏性的100倍，为牛白血病的临床诊断提供了快速准确的诊断工具，对牛白血病的流行病学调查及净化的实施具有重要的现实意义。

主权项

1.一种牛白血病毒快速检测方法，其特征是包括如下步骤：步骤1）采集发病牛及隐性带毒牛的外周血作为血液样品；步骤2）利用核酸抽提试剂盒提取血液样品DNA；步骤3）对血液样品DNA进行巢式PCR检测；第一重PCR检测引物采用片段大小为399bp的 LTR1‑1/ LTR1‑2；第二重PCR的检测引物采用片段大小279bp的LTR2‑1/ LTR2‑2；按下列配比建立第一重PCR反应体系：10×EX Taq缓冲液 5.0μL，d NTP (2.5M each) 4.0 μL，MgCL2(25uM) 4.0 μL，EX‑Taq酶 0.4 μL，LTR1‑1 (25pmol) 0.5 μL，LTR1‑2 (25pmol) 0.5 μL，血液样品DNA 1.0μL补RNase‑free水至50 μL；第一重PCR反应程序为：94℃ 5min；94℃ 1min,58℃ 1min,72℃ 1min,35个循环；72℃ 10min；反应结束后4℃恒温保存；按下列配比建立第二重PCR反应体系：10×EX Taq缓冲液 5.0μL，d NTP (2.5M each) 4.0 μL，MgCL2(25uM) 4.0 μL，EX‑Taq酶 0.4 μL，LTR2‑1 (25pmol) 0.5 μL，LTR2‑2 (25pmol) 0.5 μL，第一重PCR产物 1.0μL补RNase‑free水至50 μL；第二重PCR反应程序为：94℃ 5min；94℃ 1min,58℃ 1min, 72℃ 1min, 35个循环；72℃ 10min；反应结束后4℃恒温保存；步骤4）结果判定；取第二重PCR产物5.0 μL加1 μL（6×）上样缓冲液混匀加样；100V电泳40min后，放入10mg/mL的溴化乙锭溶液中染色10min以上，在凝胶成像系统下观察并拍照；出现目的条带的判为阳性，无目的条带的判为阴性。