[发明专利]长链非编码RNA在慢性肾病诊断与筛查中的应用

摘要

本发明公开了一种长链非编码RNA在慢性肾病诊断与筛查中的应用，该长链非编码RNA在慢性肾病诊断与筛查中的应用包括下述工艺步骤：血浆样品收集→血浆样品TotalRNA提取→LncRNAReal‑timePCR引物→Real‑timePCR反应→统计→临床试验。该长链非编码RNA在慢性肾病诊断与筛查中的应用，通过发现的lncRNA Gm4419和GAS5可作为慢性肾病病人的特异性诊断标志物，其相对于由Wfdc2基因编码的人附睾蛋白4(HE4)的特异性高，且体现在其对患有癌症的患者的检测工作中，lncRNA Gm4419和GAS5在患有癌症的患者的血清中不会增加，不受癌症的影响，使得其均具有较好的敏感度和特异度。

主权项

1.一种长链非编码RNA在慢性肾病诊断与筛查中的应用，其特征在于：所述长链非编码RNA在慢性肾病诊断与筛查中的应用包括下述工艺步骤：(1).血浆样品收集1)采集外周血1mL(CKD病人组与正常人组)，迅速转入EDTA抗凝管中，通过涡旋或用移液器混匀；2)然后在1h(室温条件下)或2h(0℃‑5℃条件下)内进行下面的操作：800g‑900g，0℃‑5℃，离心10min‑15min；3)再吸取约0.5mL上清转至洁净的1.5mL离心管中，16000g‑16200g，0℃‑5℃，离心10min‑15min，小心吸取上清到新的离心管中，置于‑80℃保存备用。(2).血浆样品TotalRNA提取1)在‑80℃冰箱取出血浆样本，冰上融化；2)取0.2ml‑0.3ml样本加入0.75mlLSReagent，通过涡旋或用移液器混匀吹打混匀，静置5min‑15min；3)然后加入0.2ml‑0.3ml氯仿，充分震荡15s‑20s，常温静置5‑15min；4)0℃‑5℃，12000xg‑12200xg离心15min，移取上清液至新的1.5ml离心管；5)向新离心管内加入1ulGlycogen(10ug/ul)，并通过涡旋或用移液器充分混匀；6)再加入0.5ml‑0.8ml异丙醇，混匀，常温孵育10min‑15min；7)0℃‑5℃，12000xg‑12200xg离心10min‑15min，弃上清液；8)加入1ml‑2ml的75％乙醇，混匀；9)0℃‑5℃，7500xg离心5min‑15min，弃上清液；10)离心管放置在超净台，并将其静置5min‑10min，不要等完全晾干，加入DEPC水20‑50ul；11)将离心管放置在干式加热器上，使得温度加热至55℃‑60℃，进行助融操作，且时间为10min‑15min，最后，收集管中的液体即为提取的TotalRNA，置于‑80℃保存备用。(3).LncRNAReal‑timePCR引物LncRNA名称5’端引物SEQID/3’端引物SEQID；Gm4419CCACGTGCACATATTTGAATTG/TGCATTCCCTGCTTAATACTCA；GAS5GACGGAGGTTGAGATGAAGC/ATTCGGGGCTCTGTAGTCCT；b‑actinTTAATCTTGCCTGGACCAGC/TACCTCAAGCCGACTCTCCA。(4).Real‑timePCR反应1)应用AppliedBiosystems7900FastReal‑TimePCRSystem的操作方法，按以下组份配置PCR反应液(反应液配置在冰上进行)：试剂及其使用量；2)进行Real‑timePCR反应两步法；阶段1：预变性95℃30sec(Reps1)阶段2：PCR反应Reps40，95℃5sec，60℃。3)计算实验结果由PCR反应曲线获得的Ct值(thresholdcyclenumber，阈值循环数)，△Ct为同一样本目的与内参基因Ct值之差，即△Ct＝Ct(所选LncRNA)‑Ct(b‑actin)，某一样本LncRNA的表达水平用2‑ΔCt表示，计算CKD病人血浆和正常人血浆中某一LncRNA的相对表达量的差异的方法是：将两组中所有血浆样本的某一LncRNA表达水平进行比较。(5).统计将本项目中病人血浆与正常对照血浆的某一LncRNA表达水平比较采用T检验，CKD病人某一LncRNA的相对表达水平与CKD临床指标之间的关系采用χ2检验，受试者工作特征曲线(ROC)和线下面积AUC用于评价每一个候选标志物的诊断价值，最佳标准值是使用Youden’sindex(回归系数)判定，每一个LncRNA回归系数是由逻辑回归模式得到的，并且作为权重构成了联合诊断预测值P，P<0.05定义为差异具有统计学意义。(6).临床试验在临床试验样本中验证了GAS5与CKD疾病指标的高度相关性，我们检测了Gm4419和GAS5、肌酐、尿素氮、胱抑素C和eGFR(肾小球滤过率)的血清水平，Pearson的相关性分析揭示了升高的血清GAS5与较高的血清肌酐，尿素氮，血清胱抑素C和较低的eGFR显著正相关。