[发明专利]一种利用CRISPR/Cas9制备重组猪伪狂犬病毒的方法在审
| 申请号： | 201811083026.1 | 申请日： | 2018-09-17 |
| 公开（公告）号： | CN109321571A | 公开（公告）日： | 2019-02-12 |
| 发明（设计）人： | 徐高原;孙芳;周明光;张华伟;郝根喜 | 申请（专利权）人： | 武汉科前生物股份有限公司 |
| 主分类号： | C12N15/113 | 分类号： | C12N15/113;C12N15/90;C12N15/65;C12N7/01 |
| 代理公司： | 北京路浩知识产权代理有限公司 11002 | 代理人： | 王文君;王璐 |
| 地址： | 430000 湖北省武*** | 国省代码： | 湖北;42 |
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| 摘要： | 本发明属于基因工程技术领域，具体公开了一种利用CRISPR/Cas9制备重组猪伪狂犬病毒的方法。本发明利用基因编辑技术CRISPR/Cas9，向PRV的gE编码区引入荧光蛋白的编码序列，成功筛选到阳性重组病毒后再用同样的技术将荧光蛋白基因替换为一段无关序列(长500bp的LysC序列)，形成插入突变，使PRV的gE蛋白表达缺失。本发明利用荧光蛋白从无到有、再从有到无的可视化筛选，简化了筛选程序，提高了重组病毒构建的效率，缩短了实验周期。并通过在猪伪狂犬病毒(PRV)的gE编码区引入插入突变，使制备的重组病毒可用作PRV减毒疫苗的研发，同时该无关序列可以用作免疫毒和野生毒的鉴别诊断。 | ||
| 搜索关键词： | 猪伪狂犬病毒 重组病毒 制备 插入突变 荧光蛋白 编码区 筛选 基因工程技术 荧光蛋白基因 编码序列 蛋白表达 减毒疫苗 鉴别诊断 利用基因 实验周期 可视化 引入 构建 可用 研发 替换 成功 | ||
【主权项】：
1.一种利用CRISPR/Cas9制备重组猪伪狂犬病毒的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：(1)利用CRISPR/Cas9系统使猪伪狂犬病毒基因组gE编码区的特定位置发生断裂；(2)利用细胞内同源重组的基因修复系统，向细胞提供带荧光标记序列的同源重组模板，在断裂位置插入荧光标记序列；(3)利用噬斑筛选技术，筛选有荧光的噬斑，接种到细胞中进行纯化，筛选得到荧光标记序列成功重组的病毒；(4)利用CRISPR/Cas9系统使步骤(3)所得的病毒的基因组在与步骤(1)所述特定位置相同的位置再次发生断裂；(5)利用细胞内同源重组的基因修复系统，向细胞提供带无关序列的同源重组模板，在断裂位置插入无关序列；(6)利用噬斑筛选技术，筛选无荧光的噬斑接种到细胞中进行纯化，得到无关序列成功重组、gE蛋白表达缺失的重组猪伪狂犬病毒。
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