[发明专利]一种抗缪勒氏管激素的抗体制备方法

摘要

本发明公开了一种抗缪勒氏管激素的抗体制备方法，包括动物免疫、饲养层细胞的制备、细胞融合、杂交瘤细胞的筛选及其克隆、单克隆抗体腹水制备及纯化等方法，本发明AMH单克隆抗体的制备方法通过将制备过程中所用的材料及步骤进行优化，最终能得到高纯度的AMH单克隆抗体，本发明所制备的AMH单克隆抗体具有效价高、亲和力好，与AMH抗原结合力强等优点，可用于免疫组化、免疫荧光、放射自显影或其他方法来定性定位或定量监测卵巢储备力、预测体外受精联合胚胎移植技术(IVF)的卵巢反应性、预防卵巢过度刺激综合征(OHSS)、男性生殖功能的评估等以辅助临床诊断。

主权项

1.一种抗缪勒氏管激素的抗体制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)动物免疫将免疫原与福氏完全佐剂等体积混合，充分乳化后，在免疫小鼠背腹部皮下多点注射100ul/只，后间隔2周，将免疫原和福氏不完全佐剂充分乳化后，经背腹部皮下多点注射100ul/只，后间隔2周，小鼠进行眼球取血，检测血清效价，取效价达到1:105的小鼠进行脾脏加强免疫，腹腔注射免疫原100uL/只，3天后取小鼠脾细胞进行细胞融合；(2)饲养层细胞的制备取BALB/c小鼠腹腔巨噬细胞和胸腺细胞作为饲养细胞，将BALB/c小鼠眼球放血致死，75％酒精体表消毒后，用消毒后的剪刀和镊子从后腹剪开腹部皮肤，暴露腹膜，用注射器取DMEM培养基至腹腔，用手指轻轻挤压腹部，并进行反复冲洗，回收冲洗液，取出小鼠的胸腺，将其碾碎后用DMEM培养基冲洗，回收洗液，将两次回收液混合后，1200rpm/min离心3min，弃上清，即得到饲养层细胞；(3)细胞融合取小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞在无血清的DMEM培养基中混匀，1300rpm离心3min，去除上清，37℃水浴中加入1mL 50％PEG‑1500并融合1min，用无血清的DMEM培养基终止融合后1300rpm离心3min，弃去上清，得到融合细胞，融合细胞用HAT培养基悬浮，分装到96孔含有饲养细胞的细胞板中，置于37℃，含5％CO2的细胞培养箱中培养。(4)杂交瘤细胞的筛选及其克隆5天后，等到融合细胞覆盖孔底10‑30％时，用常规间接ELISA方法筛选分泌抗体的阳性孔，即以AMH重组蛋白为抗原，用CBS缓冲液(50mM,pH＝9.5)稀释到0.5ug/ml包被96孔酶标板，50ul/孔，4℃包被过夜，拍干后，用封闭液200ul/孔的量封闭，37℃封闭2小时，拍干备用；将待检细胞培养上清50ul/孔加入上述ELISA板中，于37℃反应30min后洗涤并拍干，洗涤液PBS缓冲液(50mM,pH＝7.2)，加入50ul/孔的HRP标记的羊抗鼠IgG，于37℃孵育30min后洗涤并拍干，加入50ul/孔的TMB显色液，于37℃避光显色10min,加入25ul/孔的2M H2SO4终止反应，并于OD450处读取数值,阳性孔的确定原则：OD450值/阴性对照值≥2.1,选择呈强阳性反应的细胞孔，采用有限稀释法克隆，克隆多次，待AMH单克隆细胞株阳性率100％即确定为稳定杂交瘤细胞株，经扩大培养后，用于腹水制备和液氮保存；(5)单克隆抗体腹水制备及纯化取8周龄左右KM雌性小鼠，腹腔注射石蜡，7‑10天后腹腔注入杂交瘤细胞，注射后7‑10天可见小鼠腹部明显膨大，注射针头采集腹水，2000rpm离心3min，收集上清液即为单抗腹水,取1倍体积单抗腹水加2倍体积醋酸缓冲液(60mM，pH＝4.8)稀释，4℃静置1h，2000rpm离心20min，收集上清，再用50％饱和硫酸铵沉淀单抗，4℃放置2h，3000rpm离心20min，弃去上清，沉淀用2倍体积的PBS缓冲液(50mM,pH＝7.2)溶解，在4℃流动透析24h后即获纯化的AMH单克隆抗体，‑70℃保存。