[发明专利]一种甲型流感病毒亚型分型检测方法

摘要

本发明公开了一种甲型流感病毒亚型分型检测方法，包括以下步骤：步骤一、设计与合成引物；步骤二、制备连接有磁珠连接正向引物的羧基磁珠；步骤三、甲型流感病毒RNA提取；步骤四、RT‑PCR；步骤五、磁吸附与洗涤；步骤六、检测。本发明的甲型流感病毒亚型分型检测方法，能够高通量、快速、灵敏、特异性对甲型流感病毒亚型进行分型，具有很好的应用价值。

主权项

1.一种甲型流感病毒亚型分型检测方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一、设计与合成引物：根据甲型流感病毒各亚型的特异性的基因序列，分别设计出对应的正向引物和反向引物；在所述正向引物的5’端连接上‑NH2‑(CH2)n‑Tm得到磁珠连接正向引物，n＝4～8，m＝14～18；在所述反向引物的5’端带上荧光标记得到5’端带荧光标记的反向引物，针对不同的甲型流感病毒亚型选择不同的荧光标记；合成甲型流感病毒各亚型的所述正向引物、所述磁珠连接正向引物和所述5’端带荧光标记的反向引物；步骤二、制备连接有磁珠连接正向引物的羧基磁珠：将所述步骤一得到的甲型流感病毒各亚型的磁珠连接正向引物分别与羧基磁珠连接，得到甲型流感病毒各亚型的连接有磁珠连接正向引物的羧基磁珠；步骤三、甲型流感病毒RNA提取；步骤四、RT‑PCR：以所述步骤一得到的甲型流感病毒各亚型的所述正向引物、所述5’端带荧光标记的反向引物和所述步骤二得到的甲型流感病毒各亚型的连接有磁珠连接正向引物的羧基磁珠为引物，以所述步骤三得到的甲型流感病毒RNA为模板，进行RT‑PCR反应；步骤五、磁吸附与洗涤：RT‑PCR反应结束后，在磁性作用下，磁珠被吸附聚集，用洗涤液洗涤磁珠，去掉未与磁珠连接的荧光标记；步骤六、检测：采用酶标仪或者流式细胞仪检测所述步骤五得到的磁珠上的荧光标记信号，从而确定甲型流感病毒的亚型。