[发明专利]一种在干细胞中进行基因定向敲入的方法有效
| 申请号： | 201810786497.2 | 申请日： | 2018-07-17 |
| 公开（公告）号： | CN109055373B | 公开（公告）日： | 2019-09-20 |
| 发明（设计）人： | 李程;严颖刚;丁秋蓉 | 申请（专利权）人： | 杭州观梓健康科技有限公司 |
| 主分类号： | C12N15/113 | 分类号： | C12N15/113;C12N15/864;C12N15/90;C12N5/10 |
| 代理公司： | 北京英创嘉友知识产权代理事务所(普通合伙) 11447 | 代理人： | 耿超;王浩然 |
| 地址： | 310000 浙江省杭州市余杭*** | 国省代码： | 浙江;33 |
| 权利要求书： | 查看更多 | 说明书： | 查看更多 |
| 摘要： | 本公开提供了一种在干细胞中进行基因定向敲入的方法，该方法包括如下步骤：S1、将针对待敲入的靶位点的经化学修饰的sgRNA和Cas9蛋白混合以形成RNP复合物；S2、形成待转染AAV病毒颗粒；S3、将干细胞的悬液与所述RNP复合物的悬液混合并进行电转，得到电转后的培养物；S4、向所述电转后的物料中加入待转染的AAV病毒颗粒的悬液以进行的转染，得到转染后的培养物；S5、将所述转染后的培养物极限稀释后进行单克隆化培养，通过PCR及测序并筛选出进行了基因定向敲入的单克隆细胞株。通过上述技术方案，本发明建立了一种无需筛选标记，可显著提高大片段基因敲入干细胞效率的技术方案。 | ||
| 搜索关键词： | 转染 干细胞 培养物 电转 悬液 复合物 基因 单克隆细胞株 大片段基因 单克隆化 化学修饰 筛选标记 靶位点 稀释 测序 蛋白 筛选 | ||
【主权项】：
1.一种在干细胞中进行基因定向敲入的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：S1、将针对待敲入的靶位点的sgRNA和Cas9蛋白混合以形成RNP复合物；S2、将插入有模板DNA的同源重组载体包装到AAV病毒中，形成待转染AAV病毒颗粒；S3、将干细胞的悬液与所述RNP复合物的悬液混合并进行电转，得到电转后的培养物；S4、在电转结束后5‑20分钟内，向所述电转后的物料中加入待转染的AAV病毒颗粒的悬液以进行8‑24小时的转染，得到转染后的培养物；S5、将所述转染后的培养物极限稀释后进行单克隆化培养，并通过PCR及测序筛选出进行了基因定向敲入的单克隆细胞株。
下载完整专利技术内容需要扣除积分，VIP会员可以免费下载。
该专利技术资料仅供研究查看技术是否侵权等信息，商用须获得专利权人授权。该专利全部权利属于杭州观梓健康科技有限公司，未经杭州观梓健康科技有限公司许可，擅自商用是侵权行为。如果您想购买此专利、获得商业授权和技术合作，请联系【客服】
本文链接：http://www.vipzhuanli.com/patent/201810786497.2/，转载请声明来源钻瓜专利网。
