[发明专利]一种检测组氨酸磷酸化蛋白的ELISA检测试剂盒及检测方法

摘要

本发明涉及一种检测组氨酸磷酸化蛋白的ELISA检测试剂盒及检测方法，属于生物技术领域。主要技术方案如下：一种检测组氨酸磷酸化蛋白的ELISA检测试剂盒，包括：包被有组氨酸磷酸化OVA蛋白包被抗原的酶标板、酶标物、洗涤缓冲液、包被缓冲液、封闭液、磷酸化组氨酸结构类似物抗体、底物显色液、反应终止液；所述酶标物为辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗体；所述洗涤缓冲液为25mM Tris pH 8.5，137mM NaCl，2.7mM KCl，0.1％v/v吐温20。本发明提供组氨酸磷酸化蛋白抗体纯度高，特异性结合能力好。本发明采用的组氨酸磷酸化蛋白检测方法操作简单，高效灵敏，易于标准化。

主权项

1.一种检测组氨酸磷酸化蛋白的ELISA检测试剂盒，其特征在于，包括：包被有组氨酸磷酸化OVA蛋白包被抗原的酶标板、酶标物、洗涤缓冲液、包被缓冲液、封闭液、磷酸化组氨酸结构类似物抗体、底物显色液、反应终止液；所述酶标物为辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗体；所述洗涤缓冲液为25mM Tris pH 8.5，137mM NaCl，2.7mM KCl，0.1％v/v吐温20；所述包被缓冲液为0.015M Na2CO3，0.035M NaHCO3，pH 9.6；所述封闭液为1wt％BSA的PBST；所述底物显色液为TMB显色液；所述反应终止液为2M H2SO4；所述磷酸化组氨酸结构类似物抗体的制备方法如下：(一)制备磷酸化组氨酸结构类似物完全抗原称取磷酸化组氨酸结构类似物、N‑羟基琥珀酰亚胺、1‑(3‑二甲氨基丙基)‑3‑乙基碳二亚胺盐酸盐依次溶于N，N‑二甲基甲酰胺中，20‑30℃下搅拌反应，得到活化溶液A；称取载体蛋白溶于碳酸氢钠溶液中，磁力搅拌，得到溶液B；在冰水浴下，将活化溶液A缓慢滴加到溶液B中，磁力搅拌，得到溶液C；将溶液C装入透析袋中，透析并离心得到完全抗原；所述磷酸化组氨酸结构类似物的化学名称为：1‑(4‑氨基丁基)‑1‑氢‑吡唑‑4‑基膦酸，所述磷酸化组氨酸结构类似物的化学式为：(二)制备磷酸化组氨酸结构类似物抗体称取步骤(一)制备的完全抗原与等量的弗氏完全佐剂充分乳化用于基础免疫，或与等量的弗氏不完全佐剂充分乳化用于加强免疫，每次免疫间隔20天，共免疫3次；第三次免疫14天后将免疫动物处死取血，取得100mL血液；先将血液放在冰水浴下静置4小时，然后6000rpm离心10min，得到抗血清，将抗血清经亲和层析纯化得到磷酸化组氨酸结构类似物抗体。