[发明专利]一种微囊藻毒素的克级别的大规模提取纯化方法

摘要

本发明公开了一种微囊藻毒素的克级别大规模提取纯化方法，步骤是：A、野外水华藻类样品筛选：进行产毒微囊藻样品的预采集和筛选；B、样品采集、清洗、阴干、粉碎：采集的水华微囊藻样品除去杂物，研磨粉碎，制成干藻粉；C、毒素抽提；D、微过滤：经过微滤，对滤液进过滤，取微滤处理后澄清的滤过液；E、超滤：通过超滤实现了基于分子大小的膜分离原理的物理方法对微囊藻毒素的分离纯化；F、纯化、除杂质：将毒素洗脱液在旋转蒸发器上蒸发干燥，得到微囊藻毒素的粗提物粉末；G、制备型HPLC纯化：纯化得到色谱纯度的微囊藻毒素的纯品。方法易行，操作简便，HPLC检测的纯度85％，可作为色谱标准样品使用，及用于微囊藻毒素的毒理学实验中。

主权项

1.一种微囊藻毒素的克级别的大规模提取纯化方法，其步骤是：A、野外水华藻类样品筛选：在产毒水华蓝藻严重爆发的水体，进行产毒微囊藻样品的预采集和筛选，野外产毒微囊藻样品，显微镜镜检微囊藻度>98％；经分析型高效液相色谱检测野外产毒微囊藻毒素的总含量>0.7‰；高效液相色谱检测中，野外产毒水华微囊藻分析，其微囊藻毒素不同异构体的出峰分离，毒素峰与相邻共存物出峰的分离度>1.5；所述的产毒微囊藻样品为野外水华微囊藻群体，呈球形、长圆形，形状不规则网状或窗格状，群体无色、柔软有溶解性的胶被，细胞球形或长圆形，细胞淡蓝绿色或橄榄绿色，往往有气泡，自由漂浮于水中，或附着于水中的基质上；B、样品采集、清洗、阴干、粉碎：步骤(A)野外产毒水华微囊藻样品用孔径50‑100μm滤网采集至产毒水华蓝藻严重爆发的水体，采集的水华微囊藻样品除去杂物，用自来水冲洗3‑5次，将处理后的藻样在塑料布上平摊均匀，温度控制在室温下，在通风避光的环境下自然阴干处理6‑72h，研磨粉碎，制成粒径在50‑200目的干藻粉；C、毒素抽提：取干藻粉1.0kg，按1：15‑1:40重量体积比添加0.1M磷酸缓冲液，pH为6.6－7.5，室温下搅拌抽提3‑6小时，用孔径50‑100μm的尼龙筛绢滤布过滤，取滤液，滤渣再按1：10‑1：20重量体积比添加0.1M磷酸缓冲液搅拌3‑6小时，再次提取1‑2次，孔径50‑100μm的尼龙筛绢滤布过滤后，合并2‑3次提取的全部滤液；D、微过滤：经过1‑5μm微滤、0.22‑0.45μm微滤过滤，对滤液进行进一步的过滤，取微滤处理后澄清的滤过液；E、超滤：步骤(D)滤过液采用截留分子量为1‑10万的中空纤维超滤器，在天利TL‑BT‑600T泵的作用下进行超滤处理，提取液中微囊藻毒素的分子量为1000，易溶于水，在超滤的作用下，小分组的微囊藻毒素快速通过超滤柱；各类杂蛋白大分子不能通过超滤柱，基于超滤的膜分离，通过超滤实现了基于分子大小的膜分离原理的物理方法对微囊藻毒素的分离纯化；F、纯化、除杂质：将步骤(E)超滤的滤过液分别倒入实验用白瓷盘内，在室内通风、避光的条件下晾干处理6‑48h，用蒸馏水将瓷盘内的毒素再次溶解，溶解后的液体用ODS‑C18反相固相萃取柱继续纯化，用固相萃取柱的C18填料10g填充制作固相萃取柱，填充的固相萃取柱先用100ml的100％V/V甲醇活化，再用20ml蒸馏水平衡，超滤滤过液每过1‑3L后清洗C18柱，先用20ml的20％V/V甲醇淋洗C18柱，洗去杂质，再用20ml－40ml的90％V/V甲醇将毒素洗脱，反复2‑4次过柱并洗脱毒素，将毒素的洗脱液在旋转蒸发器上蒸发干燥，得到微囊藻毒素的粗提物粉末；G、制备型高效液相色谱纯化：将步骤(F)制备的微囊藻毒素的粗提物用5‑20％V/V乙腈溶液含0.1％TFA溶解后，在制备型高效液相色谱上，采用乙腈流动相、梯度淋洗进行纯化，收集毒素出峰中段，旋转蒸发器蒸干后再次加5‑20％V/V乙腈0.1％TFA溶解，反复制备2‑4次，收集包含毒素峰的高效液相色谱纯化后溶液，旋转蒸发器上蒸发干燥后，纯化得到色谱纯度>85％的微囊藻毒素的纯品。