[发明专利]一种高效制备O-GlcNAc修饰蛋白的大肠杆菌表达体系有效
| 申请号： | 201810499019.3 | 申请日： | 2018-05-23 |
| 公开（公告）号： | CN110527691B | 公开（公告）日： | 2022-02-11 |
| 发明（设计）人： | 顾玉超;高红;于文功 | 申请（专利权）人： | 中国海洋大学 |
| 主分类号： | C12N15/70 | 分类号： | C12N15/70;C12N1/21;C12R1/19 |
| 代理公司： | 暂无信息 | 代理人： | 暂无信息 |
| 地址： | 266100 山*** | 国省代码： | 山东;37 |
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| 摘要： | 本发明公开了一种高效制备O‑GlcNAc修饰蛋白的大肠杆菌表达体系，以及该体系的构建方法，同时给出一种解决大肠杆菌双质粒表达系统兼容性问题的方法。本发明通过过表达大肠杆菌UDP‑GlcNAc合成通路的关键酶GlmM和GlmU，提高宿主菌株的UDP‑GlcNAc水平。UDP‑GlcNAc作为OGT进行O‑GlcNAc修饰的底物，其浓度的提高可以增加蛋白的O‑GlcNAc修饰水平。其构建方法包括以下步骤：克隆OGT、GlmU和GlmM基因；构建原核表达载体；蛋白诱导表达与检测；HPLC分离检测UDP‑GlcNAc。本发明还涉及该体系在提高多种底物蛋白O‑GlcNAc修饰水平上的应用。本发明提供了一种广泛兼容，且高效简便提高蛋白O‑GlcNAc修饰水平的方法，对研究O‑GlcNAc修饰蛋白的酶活性、蛋白相互作用和结构作用有重要意义，为研究蛋白O‑GlcNAc修饰的生理生化性质提供了有效工具。 | ||
| 搜索关键词： | 一种 高效 制备 glcnac 修饰 蛋白 大肠杆菌 表达 体系 | ||
【主权项】：
1.一种在大肠杆菌宿主细胞中生产OGT、GlmM和GlmU，制备O-GlcNAc修饰蛋白的大肠杆菌表达体系，所述体系的构建方法包括：/n（1）通过分子克隆技术，以氯霉素抗性的pBAC质粒为原核表达载体同时表达OGT、GlmU和GlmM；/n（2）重组质粒蛋白转录水平和翻译水平表达效率的测定；/n（3）重组质粒与底物蛋白质粒共转到大肠杆菌BL21；/n（4）底物蛋白O-GlcNAc修饰检测。/n
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