[发明专利]一种基于特有识别序列的绝对定量转录组文库构建方法

摘要

本发明公开了一种基于特有识别序列的绝对定量转录组文库构建方法。以片段化mRNA为模板，使用带有通用接头序列的引物池在逆转录酶的作用下合成第一条cDNA链，利用酶促反应在合成的cDNA 3’端加上带有特有识别UID序列的建库接头，使每一条cDNA带有唯一的序列标签；最后，利用通用建库接头进行PCR扩增，获得RNA文库。本发明首次使用夹板连接法基于单链cDNA构建RNA文库，同时使用UID序列精确还原PCR扩增前的cDNA组成，可实现对转录本的精确定量；本发明使用单链cDNA为原料进行文库构建，省去了第二链合成的步骤、降低了模板损失率，节省了成本和时间，彻底解决现有技术只能对转录本相对定量的不足。

主权项

1.一种带有特有识别序列UID的建库接头，其特征在于：为UID‑5a和UID‑5b通过退火形成部分双链及部分单链的接头，其中UID‑5a的序列从5’到3’依次为illumina/Life文库PCR引物的识别序列5a序列、UID序列、anchor序列、5~10个随机碱基N和3’NH₂修饰；其中5a序列与5b序列互补配对，UID序列为5~10个随机碱基N，anchor序列为4~10个固定的碱基，用于确定UID序列的位置，N为四种碱基A、T、C、G中的任意一种；UID‑5b的序列从5’到3’依次为5’PO₄修饰、anchor’序列、UID’序列和5b序列；其中anchor’序列与anchor序列互补配对，UID’序列与UID序列互补配对，5b序列与5a序列互补配对；UID‑5a和UID‑5b通过退火形成UID‑5a的3’末端突出的部分双链结构；反应溶液中的建库接头为混合物。