[发明专利]一种基于特有识别序列的绝对定量转录组文库构建方法

说明书

本发明公开了一种基于特有识别序列的绝对定量转录组文库构建方法。以片段化mRNA为模板，使用带有通用接头序列的引物池在逆转录酶的作用下合成第一条cDNA链，利用酶促反应在合成的cDNA 3’端加上带有特有识别UID序列的建库接头，使每一条cDNA带有唯一的序列标签；最后，利用通用建库接头进行PCR扩增，获得RNA文库。本发明首次使用夹板连接法基于单链cDNA构建RNA文库，同时使用UID序列精确还原PCR扩增前的cDNA组成，可实现对转录本的精确定量；本发明使用单链cDNA为原料进行文库构建，省去了第二链合成的步骤、降低了模板损失率，节省了成本和时间，彻底解决现有技术只能对转录本相对定量的不足。

技术领域

本发明属于基因测序技术领域，具体涉及一种基于特有识别序列UID的绝对定量转录组文库构建方法。

背景技术

mRNA占细胞总RNA的3％左右，但由于其最终翻译成蛋白质，参与物种的表型构成，一直是研究的焦点。近十年来，二代测序的高速发展推动着生命科学的不断进步，伴随着二代测序技术的大规模应用，研究者对生命科学领域的认识也更加深入。与基因组相比，转录组包含了时间和空间的限定，而且转录组远小于基因组，相同覆盖倍数的情况下，所需的测序数据量也远远小于基因组所需数据量，使得转录组测序成为更经济、更有效的研究方案。

Duplication指测序数据中reads的重复。测序文库构建过程中，通常会进行10轮左右的PCR扩增循环，然后上机测序，扩增引入重复。另一方面，建库时的RNA随机打断也能产生长度和序列完全一致的片段，这部分重复片段可称为天然重复(真重复)，这与PCR扩增重复(假重复)存在本质区别，需要区分。同时扩增过程是不均一的，容易PCR扩增的模板分子会得到更多的扩增片段，即更高的duplication。这导致基因表达定量不准确。

然而目前的常规转录组测序是以PCR后的转录本丰度来反映原始样本中的转录本丰度，因此PCR偏好性产生的扩增重复对表达量分析必然造成干扰。另一方面，如果在分析时去除所有的重复reads，留下完全不重复的reads。虽然可以去除所有扩增重复，但天然重复也被剔除，还会造成有效测序数据量减少。因此如何区分真假重复是表达量准确定量的关键。

因此需要开发一种技术，保留样本中的天然重复，并去掉扩增引入的重复。

发明内容

本发明针对现有技术中常规转录组测序的PCR偏好性产生的扩增重复对表达量分析造成干扰、以及在分析时去除所有的重复reads，造成天然重复被剔除的技术问题，提供一种基于特有识别序列UID的绝对定量转录组文库构建方法，该方法在文库扩增之前为每一条RNA片段加上带有特有识别序列UID的接头，因此同一个片段扩增出来的产物均带有相同的标签，而天然重复片段则带有不同的标签。测序完成后利用UID序列过滤数据，将相同标记的扩增产物进行合并，就能准确去除PCR扩增重复、同时保留样本的天然重复，一比一准确还原样本扩增前的原始状态，真正实现表达量的精准化、数字化定量分析。另外，PCR扩增和测序错误同样可以被纠正。扩增和测序过程中的错误会使得相同UID序列对应多个不同的序列，那么只需比较这些序列的相似性，基于相似性即可纠正这些错误，并将最后的一致性序列作为样本中的原始序列。本发明提供的方法具有建库效率高，建库步骤少，RNA起始量低的特点，尤其是能够彻底解决现有技术无法对转录本精确定量的不足。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：