[发明专利]一种基于特有识别序列的绝对定量转录组文库构建方法

权利要求书

1.一种基于特有识别序列UID的建库接头的绝对定量转录组文库构建方法，其特征在于，

1) 所述特有识别序列UID的建库接头为UID-5a和UID-5b通过退火形成部分双链及部分单链的接头，其中UID-5a的序列从5’到3’依次为5a序列、UID序列、anchor序列、5~10个随机碱基N和3’NH₂修饰；其中5a序列为illumina/Life文库PCR引物的识别序列，UID序列为5~10个随机碱基N，anchor序列为4~10个固定的碱基，N为四种碱基A、T、C、G中的任意一种；UID-5b的序列从5’到3’依次为5’PO₄修饰、anchor’序列、UID’序列和5b序列；其中anchor’序列与anchor序列互补配对，5b序列与5a序列互补配对；UID-5a和UID-5b通过退火形成UID-5a的3’末端突出的部分双链结构；反应溶液中的建库接头为混合物;

2) 所述文库构建方法，包括以下步骤：

(1) 从生物样品中分离RNA样品；

(2) RNA片段化：

使用高温离子打断法将RNA片段化，获得长度为200~500bp的RNA片段；

(3) 逆转录合成cDNA：

使用随机通用引物池进行所述RNA片段的逆转录，随机通用引物的序列从5’到3’依次为一段通用接头序列和一段随机序列，其中随机序列为4~10个随机碱基N，N为四种碱基A、T、C、G中的任意一种，引物池中为随机通用引物的混合物；

(4) 使用夹板连接法连接接头：

使用T4连接酶将所述的带有特有识别序列UID的建库接头连接到步骤3）的cDNA片段的3’端；

(5) 文库扩增：

以步骤(4)加了UID的建库接头的cDNA为模板，用上下游引物对进行PCR扩增；所述上游引物PCR-F-primer的3’端序列与步骤(4)的建库接头的5b序列互补配对，下游引物PCR-R-primer的3’端序列与步骤(3)的随机通用引物的通用接头序列配对的，且带有区别不同样本的index。

2.根据权利要求1所述的基于特有识别序列UID的建库接头的绝对定量转录组文库构建方法，其特征在于，步骤3）中使用的随机通用引物的序列如SEQ ID NO：1所示，

步骤4）中带有特有识别序列UID的建库接头的UID-5a的序列如SEQ ID NO：2所示，其带有3’NH₂修饰，UID-5b的序列如SEQ ID NO：3所示，其带有5’PO₄修饰；步骤5）使用的上游引物PCR-F-primer的序列如SEQ ID NO：4所示，下游引物PCR-R-primer的序列如SEQ ID NO：5所示。

3.根据权利要求1所述的基于特有识别序列UID的建库接头的绝对定量转录组文库构建方法，其特征在于，所述的RNA样品是mRNA、lncRNA、miRNA、紫外交联免疫沉淀回收的RNA和RNA免疫共沉淀获得的RNA中的一种。

4.一种构建绝对定量转录组文库的试剂盒，其特征在于，包括：

（1）随机通用引物池，引物池为随机通用引物的混合物，随机通用引物的序列从5’到3’依次为一段通用接头序列和一段随机序列，其中随机序列为4~10个随机碱基N，N为四种碱基A、T、C、G中的任意一种；

（2）带有特有识别序列UID的建库接头，为UID-5a和UID-5b通过退火形成部分双链及部分单链的接头，其中UID-5a的序列从5’到3’依次为5a序列、UID序列、anchor序列、5~10个随机碱基N和3’NH₂修饰；其中5a序列为illumina/Life文库PCR引物的识别序列，UID序列为5~10个随机碱基N，anchor序列为4~10个固定的碱基，用于确定UID序列的位置，N为四种碱基A、T、C、G中的任意一种；UID-5b的序列从5’到3’依次为5’PO₄修饰、anchor’序列、UID’序列和5b序列；其中anchor’序列与anchor序列互补配对，UID’序列与UID序列互补配对，5b序列与5a序列互补配对；UID-5a和UID-5b通过退火形成UID-5a的3’末端突出的部分双链结构；反应溶液中的建库接头为混合物；在绝对定量转录组文库构建中，使用T4连接酶将所述的带有特有识别序列UID的建库接头的UID-5b的5’端连接到cDNA片段的3’端；

（3）文库扩增上下游引物对，所述上游引物PCR-F-primer的3’端序列与（2）的建库接头的5b序列互补配对，下游引物PCR-R-primer的3’端序列与(1)的随机通用引物的通用接头序列配对的，且带有区别不同样本的index;

所述随机通用引物的序列如SEQ ID NO：1所示，特有识别序列UID的建库接头的UID-5a的序列如SEQ ID NO：2所示，其带有3’NH₂修饰，UID-5b的序列如SEQ ID NO：3所示，其带有5’PO4修饰；文库扩增使用的上游引物PCR-F-primer的序列如SEQ ID NO：4所示，下游引物PCR-R-primer的序列如SEQ ID NO：5所示。