[发明专利]一种筛选异种移植供体猪最佳基因组合的方法

摘要

本发明涉及一种筛选异种移植供体猪最佳基因组合的方法，属动物生物技术领域。以人成纤维细胞为研究对象，建立人成纤维细胞体外相容性评价方法，用此方法验证已报道的心脏或其他移植存活时间长的基因修饰猪成纤维细胞的结果，筛出更适合的补体调节因子、免疫应答因子及抗凝血因子，在GTKO的基础上，对上述因子组合后进行定点敲入或敲除，再对不同多因子组合的猪成纤维细胞用此方法进行早期筛选，获得3种以上最佳基因组合的细胞再克隆，克隆猪进行猪‑非灵长类的心脏移植验证此筛选方法的可靠性。本发明不需在获得基因组合修饰猪的基础上即可评价最佳基因组合，将极大地节约基因组合筛选时间和经费投入，对开发真正的异种移植供体猪具有重大的意义。

主权项

1.一种筛选异种移植供体猪最佳基因组合的方法，其特征在于：具体步骤为：1）建立人成纤维细胞体外相容性评价平台以人成纤维细胞作为实验对象，进行人血清介导的细胞增殖实验，人血清介导的细胞毒性实验，补体活化检测、抗体结合实验、补体活性抑制检测等免疫检测实验，再进行凝血反应检测和淋巴细胞活性检测，以样本每项检测结果的平均值记为100分，并列出相应的评分标准，建立人成纤维细胞体外相容性评价体系；2）初步建立基因修饰异种移植供体猪最佳基因组合早期快速筛选平台以国际上已报道的心脏移植存活时间相对较长的基因修饰猪成纤维细胞为研究对象，用人的补体对细胞进行孵育，利用多功能酶标仪检测补体处理后细胞存活情况，将基因修饰的猪成纤维细胞在人混合血清中培养，收集血清，检测血清中补体、免疫球蛋白的消耗情况，结果判定时以人的成纤维细胞作为参考值，不同基因修饰猪成纤维细胞根据不同的实验结果记相应的分值，初步建立基因修饰异种移植供体猪最佳基因组合早期快速筛选平台；3）利用已初步建立的评价体系对不同基因组合修饰的细胞进行评估在GTKO的基础上，采用2个补体调节因子hCD55、hCD46，3个凝血调节因子hTBM、CD73、TFPI，4个细胞免疫应答调节因子CⅡTA、B2M、LEA29Y、CD47，2个抗凋亡因子A20、HO‑1，根据相同基因数量不同基因类型组合方法或不同基因数量不同基因类型组合方法获得多基因修饰猪成纤维细胞，利用已初步建立的基因修饰异种移植供体猪最佳基因组合早期快速筛选平台，对上述多基因修饰的猪成纤维细胞记分后进行早期筛选，从中筛选出3种以上的最佳的基因修饰组合。