[发明专利]重组霍乱毒素B亚基蛋白、PEDV灭活疫苗及制备与应用

摘要

本发明涉及一种重组蛋白，具体涉及一种重组霍乱毒素B亚基蛋白、PEDV灭活疫苗及制备与应用。本发明将表达重组霍乱毒素B亚基蛋白的菌株诱导表达后经变性、纯化、复性和交联，得到重组霍乱毒素B亚基蛋白。该重组蛋白与质量分数为0.4％的壳聚糖溶液充分混合制备成佐剂，再与灭活后的PEDV混合，制得PEDV灭活疫苗。该佐剂在口服免疫小鼠后不但能明显提升灭活PEDV疫苗的局部黏膜免疫效果，还能在血清中加强其全身性免疫效果，该疫苗对实验动物没有致病性，且免疫动物后，在血清及肠组织产生的猪流行性腹泻病毒抗体速度快、水平高且持续时间长。

主权项

1.一种重组霍乱毒素B亚基蛋白的制备方法，其特征在于包含如下步骤：(1)表达：将表达重组霍乱毒素B亚基蛋白的菌株诱导表达，然后将菌体破碎，分离，收集破碎后的菌体；(2)变性：步骤(1)收集的破碎后的菌体洗涤后加入变性液，超声至澄清，然后30～40℃变性处理1.5～2.5h；离心，收集上清，过滤除杂，得到清液；(3)纯化：将步骤(2)制得的清液采用镍柱纯化，得到重组霍乱毒素B亚基纯化蛋白；(4)复性：将步骤(3)中制得的重组霍乱毒素B亚基纯化蛋白依次在8M、6M、4M、2M和0M尿素溶液中透析，得到复性后的重组霍乱毒素B亚基纯化蛋白；(5)交联：冰浴条件下，将壳聚糖/醋酸溶液与步骤(4)制得的复性后的重组霍乱毒素B亚基纯化蛋白混合均匀，调整体系pH值为5.3～5.8；然后20～40℃搅拌处理5～15min，随后边搅拌边缓慢滴加三聚磷酸钠溶液，其中，交联剂三聚磷酸钠和壳聚糖的质量比1:5；滴加完成后继续搅拌进行交联反应；离心，弃上清，收集沉淀并重溶，得到重组霍乱毒素B亚基蛋白。