[发明专利]一种利用基因工程手段高效创制低木质素含量紫花苜蓿的方法

摘要

本发明涉及一种利用基因工程手段高效创制低木质素含量紫花苜蓿的方法。将紫花苜蓿无菌苗子叶预培养后，用含反义表达载体p2300‑ubi‑4fan‑4CL的农杆菌LBA4404菌液进行浸染，经共培养、愈伤组织诱导、分化培养，形成不定芽；当不定芽长至2cm～3cm时，转入生根培养基生根；当根长至2～3cm时，将生根苗移栽到混合好的基质中。对再生植株进行分子鉴定、木质素含量测定。采用本发明获得一代转化后代只需55‑60d，而且100％为阳性植株、木质素含量较野生型降低10％以上、生长正常。本发明为高效培育低木质素紫花苜蓿提供了可行的手段。

主权项

1.一种利用基因工程手段高效创制低木质素含量紫花苜蓿的方法，其特征在于，包括如下步骤：1)获得紫花苜蓿无菌苗：紫花苜蓿种子经0.1％的HgCl2灭菌后，播种在湿润的无菌滤纸上，25℃，暗培养，直至发芽，得紫花苜蓿无菌苗；2)预培养：取紫花苜蓿无菌苗的子叶，切成0.2cm2～0.3cm2小块，接种于预培培养基上，25℃，暗培养1d；3)侵染：将内含反义表达载体p2300‑ubi‑4fan‑4CL的农杆菌LBA4404的菌液于3000r/min离心10min，收集菌体，用侵染培养基重悬菌体；将步骤2)预培养1d的子叶转入菌体与侵染培养基的混合物中，120r/min，震荡处理20min，获得侵染子叶；4)共培养：将浸染子叶，转入共培培养基上，25℃、12h/日、光照度30umol/m2·s下，光照培养3d，得共培养后的浸染子叶；5)愈伤组织的诱导：将共培养后的浸染子叶接种于愈伤组织诱导培养基上，25℃、12h/日、光照度30umol/m2·s下光照培养，诱导愈伤组织的形成；6)不定芽的分化：将形成的愈伤组织切成0.2cm2～0.3cm2，转入分化培养基，25℃、12h/日、光照度30umol/m2·s下光照培养，每28d继代一次；7)生根诱导：当不定芽长至2cm～3cm时，从基部切下，转入生根培养基中生根，25℃、12h/日、光照度30umol/m2·s下光照培养；8)当生根苗的根长至2～3cm时，打开瓶口炼苗，然后移栽到混合好的基质中。