[发明专利]一种淡水水体沉积物中电子传递体系活性的测定方法

摘要

本发明提供一种淡水水体沉积物中电子传递体系活性的测定方法，利用由聚乙烯吡咯烷酮K‑30、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、硫酸镁、曲拉通按一定比例混合配置而成的缓冲溶液进行多次提取，以NADPH和NADH为电子供体，以INT为电子受体，无色的INT接收电子后变红，在490nm比色，测定过程采用三组(A(浊度空白)、B(对照空白)、C(样品测定))。本发明采用多次提取的方式，提取更充分；测定过程采用三组消除了提取液中缓冲溶液的影响，及基底溶液中磷酸盐缓冲溶液的影响；电子传递体系活性用每克干重沉积物表示，则不同采样点之间的电子传递体系活性更有可比性。

主权项

1.一种淡水水体沉积物中电子传递体系活性的测定方法，其特征在于：该方法包括以下步骤：(1)试剂的配制：A、磷酸盐缓冲液：称取35.8140g十二水合磷酸氢二钠，用蒸馏水溶解后定容至500ml，此为溶液(1)；称取15.6000g二水合磷酸二氢钠，用蒸馏水溶解后定容至500ml，此为溶液(2)；将473.5ml溶液(1)和26.5ml溶液(2)混合后即为磷酸盐缓冲液；B、硫酸镁溶液：称取0.0370g硫酸镁，用蒸馏水溶解后定容至1000ml；C、20％的曲拉通：移取1ml曲拉通至10ml离心管，并移取4ml蒸馏水与之混合得20％的曲拉通；D、缓冲溶液：称取0.3750g聚乙烯吡咯烷酮K‑30，并加入A中配制的125ml磷酸盐缓冲液、B中配制的125ml硫酸镁溶液和C中配制的2.5ml 20％的曲拉通，溶解并混合均匀成缓冲溶液；E、基质溶液：称取0.1430g NADH和0.0500gNADPH，融入54ml灭菌蒸馏水，并与A中配制的55ml磷酸盐缓冲液和C中配制的1ml 20％的曲拉通混匀成底物；F、INT溶液：称取0.0560g 2‑(4‑碘苯基)‑3‑(4‑硝基苯基)‑5‑苯基氯化四唑溶于28ml灭菌蒸馏水中制得INT溶液；(2)提取：将10ml塑料连盖圆底离心管灭菌，用注射器称取0.5g新鲜沉积物于灭菌的10ml离心管中，加步骤1)的D中配制的4ml缓冲溶液，用超声波细胞破碎仪破碎60s后，冷冻离心机离心5min，冷冻温度4℃，转速10000r/min，将上清液移入50ml离心管中后，重复以上操作再提取3次，第二次提取和第三次提取的破碎时间均为50s，第四次提取的破碎时间为30s，则每个采样点共有16ml提取液；(3)测定：分A、B、C三组，每组三个平行；A、1.5ml基质溶液+0.5ml INT溶液+1ml缓冲溶液B、1.5ml缓冲溶液+0.5ml INT溶液+1ml提取液C、1.5ml基质溶液+0.5ml INT溶液+1ml提取液先加缓冲溶液，再加提取液，再加基质溶液，最后加INT溶液，每隔40‑60s加一个采样点，从加INT溶液开始计时，过10min后进行第一次比色，比色波长490nm，第20min开始进行第二次比色，第30min开始进行第三次比色；(3)将该新鲜沉积物在60℃烘干，测定沉积物含水率；(4)计算：先由A、B、C三组在10、20、30min的值线性拟合，横坐标为时间(h)，纵坐标为吸光度(cm‑1)，分别计算斜率为kA、kB、kC，则沉积物电子传递体系活性ETSA计算公式为式中V为最后反应体积(ml)；H为总的提取液体积(L)；ε为INT‑formazan的摩尔吸光系数(L/(μmol﹒cm))；S为参加反应的提取液体积(ml)；M为0.5g沉积物干重(g)；为μmol INT‑formazan转化为μg O₂的系数。