[发明专利]一种淡水水体沉积物中电子传递体系活性的测定方法

权利要求书

1.一种淡水水体沉积物中电子传递体系活性的测定方法，其特征在于：该方法包括以下步骤：

(1)试剂的配制：

A、磷酸盐缓冲液：称取35.8140g十二水合磷酸氢二钠，用蒸馏水溶解后定容至500ml，此为溶液(1)；称取15.6000g二水合磷酸二氢钠，用蒸馏水溶解后定容至500ml，此为溶液(2)；将473.5ml溶液(1)和26.5ml溶液(2)混合后即为磷酸盐缓冲液；

B、硫酸镁溶液：称取0.0370g硫酸镁，用蒸馏水溶解后定容至1000ml；

C、20％的曲拉通：移取1ml曲拉通至10ml离心管，并移取4ml蒸馏水与之混合得20％的曲拉通；

D、缓冲溶液：称取0.3750g聚乙烯吡咯烷酮K-30，并加入A中配制的125ml磷酸盐缓冲液、B中配制的125ml硫酸镁溶液和C中配制的2.5ml 20％的曲拉通，溶解并混合均匀成缓冲溶液；

E、基质溶液：称取0.1430g NADH和0.0500gNADPH，融入54ml灭菌蒸馏水，并与A中配制的55ml磷酸盐缓冲液和C中配制的1ml 20％的曲拉通混匀成底物；

F、INT溶液：称取0.0560g 2-(4-碘苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-苯基氯化四唑溶于28ml灭菌蒸馏水中制得INT溶液；

(2)提取：将10ml塑料连盖圆底离心管灭菌，用注射器称取0.5g新鲜沉积物于灭菌的10ml离心管中，加步骤1)的D中配制的4ml缓冲溶液，用超声波细胞破碎仪破碎60s后，冷冻离心机离心5min，冷冻温度4℃，转速10000r/min，将上清液移入50ml离心管中后，重复以上操作再提取3次，第二次提取和第三次提取的破碎时间均为50s，第四次提取的破碎时间为30s，则每个采样点共有16ml提取液；

(3)测定：分A、B、C三组，每组三个平行；

A、1.5ml基质溶液+0.5ml INT溶液+1ml缓冲溶液

B、1.5ml缓冲溶液+0.5ml INT溶液+1ml提取液

C、1.5ml基质溶液+0.5ml INT溶液+1ml提取液

先加缓冲溶液，再加提取液，再加基质溶液，最后加INT溶液，每隔40-60s加一个采样点，从加INT溶液开始计时，过10min后进行第一次比色，比色波长490nm，第20min开始进行第二次比色，第30min开始进行第三次比色；

(3)将该新鲜沉积物在60℃烘干，测定沉积物含水率；

(4)计算：

先由A、B、C三组在10、20、30min的值线性拟合，横坐标为时间(h)，纵坐标为吸光度(cm^-1)，分别计算斜率为k_A、k_B、k_C，则沉积物电子传递体系活性ETS_A计算公式为

式中V为最后反应体积(ml)；H为总的提取液体积(L)；ε为INT-formazan的摩尔吸光系数(L/(μmol﹒cm))；S为参加反应的提取液体积(ml)；M为0.5g沉积物干重(g)；为μmolINT-formazan转化为μg O₂的系数。