[发明专利]一种黄热病毒重组抗原的制备及其试剂盒制作方法

摘要

本发明涉及病毒检测领域，公开了一种黄热病毒重组抗原的制备方法，包括根据抗原性预测得分较高的病毒抗原表位片段设计引物，提取黄热病毒RNA，然后进行PCR扩增、构建原核表达载体和诱导表达重组质粒；还公开了一种黄热病毒重组抗原试剂盒的制作方法，黄热病毒重组抗原试剂盒包括PVC板、硝酸纤维素膜，硝酸纤维素膜上设有检测线和对照线，检测线上包被黄热病毒重组抗原，对照线上包被IgM抗体，以及辣根过氧化物酶标记的抗人μ链抗体和底物。本发明制备得到的黄热病毒重组抗原的特异性强，亲和力高，不会与其它虫媒传播病毒发生血清交叉学反应。

主权项

1.一种黄热病毒重组抗原的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一，选取抗原片段根据抗原性预测得分较高的病毒抗原表位片段设计引物，并在正向引物和反向引物5’端分别引入BamH I和Hind III酶切位点，正向引物：5’‑TAGGAATTCTCAGCTTTGACACTCAAGGGGACATCC‑3’，反向引物：5'‑GACAAGCTTCTATTACTTTCCTATTGAGCTTCCCT‑3’；步骤二，黄热病毒RNA的提取黄热病毒17D株经BHK‑21细胞培养3d后，收集培养物的上清液，4℃条件下，10000g离心10min，收集沉淀物，加入5‑10倍体积Trizol液，混匀后，4℃条件下静置5min，然后加入氯仿，摇荡15s，取第一上层水相加入水饱和酚，摇荡20s，取第二上层水相加入异丙醇，4℃条件下放置10min，4℃条件下，12000g离心10min后，取第一次沉淀，加入75％乙醇，4℃条件下，8000g离心5min，再取第二次沉淀加入75％乙醇，4℃条件下，8000g离心5min，得到黄热病毒RNA，室温下干燥6min后，将黄热病毒RNA溶于水中；步骤三，PCR扩增黄热病毒RNA反转录得到cDNA，然后进行PCR扩增：取cDNA2μL，10×PCR缓冲液5μL，正向引物、反向引物各2μL、dNTP 8μL、LA Taq 2U，补水至总体积50μL进行PCR扩增，扩增片段经纯化、回收后，‑20℃保存备用；步骤四，原核表达载体的构建通过BamH I和Hind III对pET28a载体和回收后的扩增片段进行限制性酶切和连接，得到重组质粒；步骤五，重组质粒的诱导表达设定温度为37℃、搅拌速度为250rpm，含有pET28a‑17D的大肠杆菌菌株Top10F在含有卡那霉素的LB培养液中生长，蛋白质生长过程中加入1mmol/L IPTG进行诱导表达，诱导时间为3h；进行12％SDS‑PAGE电泳分析。