[发明专利]基于碱基切除修复诱导的检测Dam甲基转移酶活性方法

摘要

本发明公开了一种基于碱基切除修复诱导的链置换和等温指数扩增荧光检测Dam甲基转移酶活性的方法。该方法操作步骤简单，具有良好的选择性和较高的灵敏度。经实验结果表明，其测定Dam甲基转移酶的线性范围为0.02‑10U/mL，检测限为0.014U/mL。该方法还可以用于大肠杆菌细胞中内源性Dam甲基转移酶的检测，在大肠杆菌中Dam甲基转移酶的检测限为0.61×10‑6mg/mL。

主权项

1.一种基于碱基切除修复诱导的链置换和等温指数扩增荧光检测Dam甲基转移酶活性的方法，其特征在于，该方法具体包括以下步骤：(1)发夹底物DNA、发夹模板DNA、EXPAR模板DNA和信号探针DNA的选取：发夹底物的茎部含有22对完全互补的碱基，其中包括Dam甲基转移酶的识别序列5’‑G‑A‑T‑C‑3’，且发夹底物的部分序列与发夹模板的部分序列互补；发夹模板的茎部含有8对互补碱基，为了防止非特异性扩增，发夹模板的3’端含有6个突出碱基；EXPAR模板含有两个完全相同的序列，其中EXPAR模板的延伸产物中包含U碱基；信号探针的两端分别用羧基荧光素(FAM)和四甲基罗丹明(TAMRA)标记，由于发生荧光共振能量转移，信号探针以单链存在时，荧光猝灭；信号探针的中间位置具有AP位点，且信号探针可与扩增产物杂化形成部分互补的双链；(2)发夹底物DNA和发夹模板DNA的分别退火；(3)Dam甲基转移酶对序列5’‑G‑A‑T‑C‑3’中A碱基的甲基化；(4)对甲基化敏感的限制性内切酶(Dpn I)将甲基化的发夹底物进行切割；(5)链置换反应(SDA)产生扩增产物；(6)等温指数扩增(EXPAR)循环：以步骤(5)中SDA循环后产生的扩增产物作为指数扩增的引物与EXPAR模板杂化产生大量的扩增产物；(7)扩增产物与信号探针结合形成部分互补双链DNA，Endo IV识别并切割信号探针上的AP位点，使得FAM荧光信号恢复，且释放出扩增产物，释放出的扩增产物继续与信号探针结合形成双链，Endo IV识别并切割信号探针上的AP位点，该过程可反复循环，使得荧光信号增强并对其进行检测。