[发明专利]强化YvbW表达的地衣芽胞杆菌在杆菌肽生产中的应用

摘要

本发明提供一种强化YvbW表达的地衣芽胞杆菌在杆菌肽生产中的应用，本发明通过基因工程的方法通过在地衣芽孢杆菌的基因组内插入氨基酸通透酶YvbW基因，得到地衣芽孢杆菌DW2‑yvbW，该菌株在杆菌肽发酵过程中发酵液中杆菌肽的产量提高了13％以上。

主权项

1.强化YvbW表达的地衣芽胞杆菌在杆菌肽生产中的应用，所述的强化YvbW表达的地衣芽胞杆菌的制备方法，包括以下步骤：(1)以地衣芽孢杆菌DW2的基因组DNA为模板，PCR扩增出yvbW基因片段，再在yvbW基因片段上游连接P43启动子、下游连接淀粉酶终止子，构成完整的yvbW表达元件；(2)同时，以地衣芽孢杆菌DW2的基因组DNA为模板，PCR扩增出yvbW基因的上游同源臂和yvbW基因的下游同源臂；(3)通过重叠延伸PCR将yvbW基因的上游同源臂、yvbW表达元件和yvbW基因的下游同源臂连接到一起，构成目的基因片段，该目的基因片段的排列顺序为：yvbW基因的上游同源臂‑yvbW表达元件‑yvbW基因的下游同源臂；(4)采用BamHI和XbaI限制性内切酶对目的基因片段进行双酶切得到酶切基因片段；(5)准备质粒T2(2)‑ori，并采用BamHI和XbaI限制性内切酶对质粒T2(2)‑ori进行双酶切得到线性质粒片段；(6)将步骤(4)得到的酶切基因片段和步骤(5)得到的线性质粒片段经DNA连接酶进行连接，得到整合质粒T2(2)‑yvbW；(7)将整合质粒T2(2)‑yvbW转入地衣芽孢杆菌DW2中，以卡那青霉素抗性作为筛选标记，筛选得到阳性转化子，并抽质粒进行菌落PCR验证，将验证成功的阳性转化子在45℃条件下转接培养数次后，进行菌落PCR检测，得到yvbW基因的上游同源臂或yvbW基因的下游同源臂与地衣芽孢杆菌DW2基因组DNA产生单交换的阳性单交换结合子菌株；(8)挑选yvbW基因的上游同源臂与地衣芽孢杆菌DW2基因组DNA产生单交换的阳性单交换结合子菌株与yvbW基因的下游同源臂与地衣芽孢杆菌DW2基因组DNA产生单交换的阳性单交换结合子菌株混合接种于37℃、不含有卡那青霉素的培养基中经过数次转接培养，再经PCR法筛选得到整合了yvbW基因的地衣芽孢杆菌DW2‑yvbW；其中，所述的地衣芽胞杆菌DW2已于2011年10月12日保藏于位于武汉的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2011344；所述地衣芽胞杆菌DW2的基因组DNA序列中的yvbW基因为SEQUENCE LISTING中所示；根据所述的强化YvbW表达的地衣芽胞杆菌的制备方法构建得到地衣芽胞杆菌DW2‑yvbW；所述强化YvbW表达的地衣芽胞杆菌DW2‑yvbW在抗菌肽生产中的应用，该应用步骤包括：A种子发酵，B生产发酵。