[发明专利]肿瘤相关基因甲基化检测建库方法及应用

摘要

本发明公开了肿瘤相关基因甲基化检测建库方法及应用，该方法使用内侧引物对，采用多重PCR法进行第一轮扩增，扩增产物序列分别为DNA转化的正链和负链，内侧引物5’端使用与外侧引物3’端互补的20~25个碱基，3’端使用根据目标靶点外侧的序列所设计的特异性引物序列，然后使用illumina Multiplexing PCR Primer 1.0为外侧引物F和使用3’端截断后的illumina RNA PCR Primer为外侧引物R进行第二轮扩增，从而构建文库。采用本方法可同时富集多个肿瘤相关基因，所需样本起始量超低，测序成本较低，通过双链扩增和二代测序分析，可剔除转化效率问题导致的假阳性，提高ctDNA检出率。

主权项

1.肿瘤相关基因甲基化检测建库方法，包括以下步骤：S1：从受检样本中提取DNA；S2：对S1提取的DNA进行亚硫酸盐化处理，得到转化后的DNA，由于转化后DNA序列不再互补，DNA呈现为解链状态；S3：使用内侧引物对，采用多重PCR法对S2的转化后DNA进行第一轮扩增，使得扩增的产物序列分别为DNA转化的正链和负链；S4：对S3获得的第一轮扩增产物进行纯化，去除非特异性扩增的小片段DNA和二聚体；S5：使用外侧引物，对S4所得的纯化产物进行第二轮扩增；S6：对S5获得的第二轮扩增产物进行纯化，即得肿瘤相关基因甲基化检测文库；其中，S3中的内侧引物包括针对S2的甲基化的DNA的正、负链分别设计而成的两对引物，每对内侧引物的5’端使用与外侧引物的3’端互补的20～25个碱基，3’端使用根据目标靶点外侧的序列所设计的特异性引物序列；S5中的外侧引物包括外侧引物F和外侧引物R，所述外侧引物F与illumina Multiplexing PCR Primer 1.0引物相同，所述外侧引物R采用截断了3’端的illumina RNA PCR Primer引物。