[发明专利]一种米黑根毛霉α-淀粉酶及其编码基因与应用

摘要

本发明涉及一种米黑根毛霉α‑淀粉酶及其编码基因与应用。本发明提供的蛋白质具有α‑淀粉酶活力，该蛋白质的基因在毕赤酵母中高效表达，经毕赤酵母高密度发酵后的最高酶活为29794.2U/mL，纯化后的比酶活为3502.1U/mg，最适反应pH为6.0，在pH 4.5‑8.0保持稳定；最适反应温度为75℃，在65℃以下保持较高酶活力，具有较好的耐热性。所述酶应用于馒头中，能使馒头比容增大7.7％，同时能延缓馒头老化；应用于麦芽糖生产中，麦芽糖含量能够达到54.1％。所述酶在食品行业中具有良好的应用潜力。

主权项

1.一种α‑淀粉酶，来源于米黑根毛霉CAU432，是以下1)或2)或3)的蛋白质：

1)序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

2)序列表中序列2自氨基酸末端第20至465位所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

3)将1)或2)所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且功能相同的蛋白质。

2.如权利要求1所述的α‑淀粉酶，其特征在于：所述3)中的蛋白质为人工合成，或先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

3.编码权利要求1所述蛋白质的核酸分子，其特征在于：所述核酸分子为DNA分子或RNA分子；所述DNA为cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述RNA为mRNA或hnRNA；

所述DNA分子为以下1)或2)或3)或4)的DNA分子：

1)序列表序列1所示的DNA分子；

2)序列表序列1的第58至1395位所示的DNA分子；

3)在严格条件下与1)或2)所限定的DNA分子杂交且编码权利要求1所述蛋白质的DNA分子；

4)与1)或2)或3)限定的DNA分子具有75％以上的同一性且编码权利要求1所述蛋白质的DNA分子；

所述严格条件为在0.1×SSPE，0.1％SDS的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。

4.含有权利要求3所述核酸分子的重组载体、表达盒、转基因细胞或重组菌。

5.如权利要求4所述的重组载体、表达盒、转基因细胞或重组菌，其特征在于：

所述重组载体为在载体pPIC9K的多克隆位点插入序列表中序列1所示的核苷酸序列得到的重组质粒pPIC9K‑RmAmyA；

所述重组菌通过将所述重组载体导入宿主微生物中得到；

所述宿主微生物为酵母、细菌、藻类或真菌；所述酵母为巴斯德毕赤酵母GS115。

6.如权利要求1所述α‑淀粉酶的生产方法，其特征在于：所述方法是将权利要求5所述重组菌进行发酵培养，得到所述的α‑淀粉酶。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于：所述发酵培养依次经过如下步骤：

1)种子液培养：将重组菌接种到150mL BMGY培养基中，在30℃，200rpm条件下振荡过夜培养至OD₆₀₀为2‑6，得到种子液；

2)基础培养：将步骤1)的种子液接种于含有1.5L基本培养基BSM的5L发酵罐中培养，所述培养温度为30℃，pH为4.0，转速600rpm，待甘油消耗完全，进行甘油流加培养；

3)甘油流加培养：流加质量浓度为50％的甘油，温度为30℃，pH为5.0，通过调整流加速度保持溶氧在20％‑70％，流加时间4‑6h；待菌体湿重达到180‑220g/L，停止流加甘油；

4)甲醇诱导培养：停止流加甘油后，饥饿半小时，流加100％甲醇诱导，转速800rpm，培养温度为30℃，pH为6.0，溶氧20％‑70％。

8.如权利要求7所述方法生产α‑淀粉酶的纯化方法，其特征在于：所述纯化方法是发酵液经透析除盐后，经DE52弱阴离子柱层析，用含有200mM NaCl的20mM PB、pH 6.0缓冲液洗脱收集得到纯的蛋白。

9.如权利要求1所述α‑淀粉酶的应用。

10.如权利要求9所述α‑淀粉酶的应用，其特征在于：α‑淀粉酶在面制品和麦芽糖生产中的应用。