[发明专利]一种羊膜干细胞提取、培养和纯化的方法

摘要

本发明公开了一种羊膜干细胞提取、培养和纯化的方法，具体制备步骤如下：S1：材料准备：取38±1周的无肝炎、梅毒、HIV等传染性疾病的正常剖宫产胎盘，且胎盘获取时间为产妇剖宫产后4h以内获得，然后，机械性的将羊膜与从胎盘上分离下来，同时，将脐部外周大片羊膜取下，然后将取下的羊膜放入含有双抗的PBS容器中反复洗涤并除去血液和残片；S2：羊膜干细胞的提取：(1)将S1中的羊膜片不剪碎直接加入到含有0.25％胰蛋白酶和0.02％EDTA消化液的均匀混合物的容器中，放在37℃恒温箱中处理0.5h。本发明通过将羊膜片从胎盘组织上分离、提取、培养并纯化，然后在体外扩大增殖培养，因而能够简易、便捷且规模化的得到羊膜干细胞。

主权项

1.一种羊膜干细胞提取、培养和纯化的方法，其特征在于，具体制备步骤如下：S1：材料准备：取无肝炎、梅毒、HIV等传染性疾病的正常剖宫产胎盘，机械性的将羊膜与从胎盘上分离下来，同时，将脐部外周大片羊膜取下，然后将取下的羊膜放入含有双抗的PBS容器中反复洗涤并除去血液和残片；S2：羊膜干细胞的提取：(1)将S1中的羊膜片不剪碎直接加入到含有0.25％胰蛋白酶和0.02％EDTA消化液的均匀混合物的容器中，放在恒温箱中处理0.5～1.5h；(2)用细胞刮将羊膜细胞刮除干净，并用PBS清洗2～6遍后，将羊膜片剪成1mm×1mm大小的碎片；(3)将羊膜碎片加入到含2g/LⅡ型胶原酶、0.05g/L DNaseⅠ和10％胎牛血清的DMEM消化液的混和溶液中，再放入饱和湿度培养箱中消化至羊膜碎片基本消失；(4)用200目的细胞筛网对(3)中的消化液进行过滤，并将过滤液进行收集后，离心5min，弃去上层清液；S3：羊膜干细胞的培养：(1)将双抗混合液与10％胎牛血清的DMEM消化液充分混合均匀后制成培养基；(2)将S2中的细胞放在(1)中的培养基中进行重悬后，将悬浮液接种于25cm2的细胞培养瓶中；(3)将培养瓶放入饱和湿度培养箱中进行培养；S4：羊膜干细胞的纯化：将S3中的细胞进行传代培养。