[发明专利]一种羊膜干细胞提取、培养和纯化的方法

权利要求书

1.一种羊膜干细胞提取、培养和纯化的方法，其特征在于，具体制备步骤如下：

S1：材料准备：取无肝炎、梅毒、HIV等传染性疾病的正常剖宫产胎盘，机械性的将羊膜与从胎盘上分离下来，同时，将脐部外周大片羊膜取下，然后将取下的羊膜放入含有双抗的PBS容器中反复洗涤并除去血液和残片；

S2：羊膜干细胞的提取：

(1)将S1中的羊膜片不剪碎直接加入到含有0.25％胰蛋白酶和0.02％EDTA消化液的均匀混合物的容器中，放在恒温箱中处理0.5～1.5h；

(2)用细胞刮将羊膜细胞刮除干净，并用PBS清洗2～6遍后，将羊膜片剪成1mm×1mm大小的碎片；

(3)将羊膜碎片加入到含2g/LⅡ型胶原酶、0.05g/L DNaseⅠ和10％胎牛血清的DMEM消化液的混和溶液中，再放入饱和湿度培养箱中消化至羊膜碎片基本消失；

(4)用200目的细胞筛网对(3)中的消化液进行过滤，并将过滤液进行收集后，离心5min，弃去上层清液；

S3：羊膜干细胞的培养：

(1)将双抗混合液与10％胎牛血清的DMEM消化液充分混合均匀后制成培养基；

(2)将S2中的细胞放在(1)中的培养基中进行重悬后，将悬浮液接种于25cm2的细胞培养瓶中；

(3)将培养瓶放入饱和湿度培养箱中进行培养；

S4：羊膜干细胞的纯化：将S3中的细胞进行传代培养。

2.根据权利要求1所述的一种羊膜干细胞提取、培养和纯化的方法，其特征在于：所述S1中，胎盘周数为38±1周，且胎盘获取时间为产妇剖宫产后4h以内获得。

3.根据权利要求1所述的一种羊膜干细胞提取、培养和纯化的方法，其特征在于：所述S2中的(1)恒温处理温度为37℃。

4.根据权利要求1所述的一种羊膜干细胞提取、培养和纯化的方法，其特征在于：所述S2中的(3)和S3中的(3)饱和湿度培养箱的培养温度均为37℃，且CO2的体积分数均为0.05。

5.根据权利要求1所述的一种羊膜干细胞提取、培养和纯化的方法，其特征在于：所述S3中的(1)双抗混合液为青霉素80万u+pbs 4ml，链霉素100万u+pbs 5ml，各自混匀后，再一起混匀制得。

6.根据权利要求1所述的一种羊膜干细胞提取、培养和纯化的方法，其特征在于：所述S3中的(2)细胞接种密度为1×109cells/L。

7.根据权利要求1所述的一种羊膜干细胞提取、培养和纯化的方法，其特征在于：所述S3中的(3)培养至第三天后，对细胞进行全量换液，并弃去未贴壁的细胞，之后每三天全量换液一次，待细胞到达80～90％融合时，用0.25％胰蛋白酶+0.02％EDTA消化。

8.根据权利要求1所述的一种羊膜干细胞提取、培养和纯化的方法，其特征在于：所述S4中按1∶2或1∶3的比例进行传代培养，且传代培养为5～10代。