[发明专利]一种羊膜干细胞提取、培养和纯化的方法

说明书

本发明公开了一种羊膜干细胞提取、培养和纯化的方法，具体制备步骤如下：S1：材料准备：取38±1周的无肝炎、梅毒、HIV等传染性疾病的正常剖宫产胎盘，且胎盘获取时间为产妇剖宫产后4h以内获得，然后，机械性的将羊膜与从胎盘上分离下来，同时，将脐部外周大片羊膜取下，然后将取下的羊膜放入含有双抗的PBS容器中反复洗涤并除去血液和残片；S2：羊膜干细胞的提取：(1)将S1中的羊膜片不剪碎直接加入到含有0.25％胰蛋白酶和0.02％EDTA消化液的均匀混合物的容器中，放在37℃恒温箱中处理0.5h。本发明通过将羊膜片从胎盘组织上分离、提取、培养并纯化，然后在体外扩大增殖培养，因而能够简易、便捷且规模化的得到羊膜干细胞。

技术领域

本发明涉及干细胞提取培养技术领域，特别涉及一种羊膜干细胞提取、培养和纯化的方法。

背景技术

近年来，随着干细胞技术的发展，羊膜干细胞移植已经成为新的疾病治疗的发展方向。在临床应用上，羊膜干细胞在结膜损伤修复、重建眼表、防治睑球粘连与视网膜移植等眼科临床已开展了大量工作。然而，现有的羊膜干细胞的提取和培养的方法仍比较复杂，且无法得到具有较高纯度和活性的羊膜干细胞。

因此，发明一种羊膜干细胞提取、培养和纯化的方法来解决上述问题很有必要。

发明内容

本发明的目的在于提供一种羊膜干细胞提取、培养和纯化的方法，以解决上述背景技术中提出的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种羊膜干细胞提取、培养和纯化的方法，具体制备步骤如下：

S1：材料准备：取无肝炎、梅毒、HIV等传染性疾病的正常剖宫产胎盘，机械性的将羊膜与从胎盘上分离下来，同时，将脐部外周大片羊膜取下，然后将取下的羊膜放入含有双抗的PBS容器中反复洗涤并除去血液和残片；

S2：羊膜干细胞的提取：

(1)将S1中的羊膜片不剪碎直接加入到含有0.25％胰蛋白酶和0.02％EDTA消化液的均匀混合物的容器中，放在恒温箱中处理0.5～1.5h；

(2)用细胞刮将羊膜细胞刮除干净，并用PBS清洗2～6遍后，将羊膜片剪成1mm×1mm大小的碎片；

(3)将羊膜碎片加入到含2g/LⅡ型胶原酶、0.05g/L DNaseⅠ和10％胎牛血清的DMEM消化液的混和溶液中，再放入饱和湿度培养箱中消化至羊膜碎片基本消失；

(4)用200目的细胞筛网对(3)中的消化液进行过滤，并将过滤液进行收集后，离心5min，弃去上层清液；

S3：羊膜干细胞的培养：

(1)将双抗混合液与10％胎牛血清的DMEM消化液充分混合均匀后制成培养基；

(2)将S2中的细胞放在(1)中的培养基中进行重悬后，将悬浮液接种于25cm2的细胞培养瓶中；

(3)将培养瓶放入饱和湿度培养箱中进行培养；

S4：羊膜干细胞的纯化：将S3中的细胞进行传代培养

优选的，所述S1中，胎盘周数为38±1周，且胎盘获取时间为产妇剖宫产后4h以内获得。

优选的，所述S2中的(1)恒温处理温度为37℃。

优选的，所述S2中的(3)和S3中的(3)饱和湿度培养箱的培养温度均为37℃，且CO2的体积分数均为0.05。

优选的，所述S3中的(1)双抗混合液为青霉素80万u+pbs 4ml，链霉素100万u+pbs5ml，各自混匀后，再一起混匀制得。