[发明专利]一种多组分Ku复合物的高效分析方法

摘要

本发明公开了一种多组分Ku复合物的高效分析方法，包括以下步骤：一、色谱柱构建；二、细胞培养和γ辐射；三、细胞核准备；所有的纯化蛋白均来自于细胞核提取物；四、FLAG‑HA示踪Ku86复合物的串联亲和纯化；五、iTRAQ标记肽段的制备；六、LC‑MS/MS分析；七、数据处理；八、排列测验；九、Western Blotting；十、银染。本发明通过比较这些分离平台分析来自细胞裂解物的复杂多肽复合物表明，RP‑RP胜于SCX‑RP主要由于其提高了一维峰容量；通过分析串联亲和纯化蛋白复合物，观察到相似的性能改进；最后，将这一系统整合到微型化的LC装置中，实现了复杂多肽和蛋白质复合物在低流速下的真实在线分离。

主权项

1.一种多组分Ku复合物的高效分析方法，其特征在于，包括以下步骤：一、色谱柱构建：一维色谱柱由熔融石英毛细管和入口柱筛盖子组成；一维RP色谱柱使用Waters 3.5μm Xbridge C18二氧化硅树脂包裹10cm着床形成，一维SCX色谱柱使用Sepax Technology SCX媒介包裹10cm着床形成；二维前置柱是基于硅酸盐的柱筛原位现浇在360μm O.D.×100μm I.D.熔融的二氧化硅毛细管内，用配制在1ml乙腈中的POROS 10R2树脂高密度砂浆填充，并从熔块后端加压至最终着床长度达5cm；分析柱(AC)是根据360μm O.D.×25μm I.D.熔融的二氧化硅毛细管构建，并用3.5μm直径的二氧化硅树脂包裹成着床长度为12cm；基于激光的微电机拉制仪用于形成毛细管末端约1μm，距离着床熔块2mm的集成电喷射发射端；2D RP‑RP平台基于Waters NanoACQUITY UPLC系统，装备了三个2位6孔阀；自动进样器被用来装载样品、注射一维洗脱缓冲液；RP‑RP离散的一维洗脱在20mM甲酸铵的3％乙腈下进行，SCX‑RP的一维洗脱在0.1％甲酸的10％乙腈条件下进行；细胞培养和γ辐射：HeLa S3细胞表达串联FLAG和HA多肽附加表位的Ku86生长于BD Falcon 15cm直径的组织培养皿中，每个含胎牛血清的DMEM；细胞孵育3天，之后额外增补3ml培养基，冰箱继续孵育24h；A MDS Nordion Gammacell 40Exactor用于对HeLa S3细胞的γ辐射；共有12个15cm培养皿的培植细胞用10Gy以1.1Gy/min的中央剂量率照射；接着将细胞放回保温箱，并分别在30min、2h和5h后以4个培养皿为一组撤掉；其中一组的4个培养皿做平行对照，不暴露于γ射线下；三、细胞核准备；所有的纯化蛋白均来自于细胞核提取物；四、FLAG‑HA示踪Ku86复合物的串联亲和纯化；冷冻的细胞核沉淀用2.5倍沉淀体积的细胞裂解液重悬；溶液被放置于电转平台上4℃下旋转30min；最终的细胞核裂解液在4℃、14000rpm下离心10min；上清液被转移到新的离心管中，剩下的沉淀丢弃；每个时间点的上清液在一起；琼脂糖珠子与Sigma M2鼠类antiflag抗体结合，并用800μl细胞裂解液洗3遍，然后再用80μl细胞裂解液悬浮；平均分的珠子悬浮液分别加入四个细胞核样品中，样品管放置于电转平台上4℃条件下孵育4h；用200μl的细胞裂解缓冲液洗3遍珠子，再用200μl HA缓冲液洗1遍；Ku86蛋白复合物通过添加18.5μl HA缓冲液和1.5μl浓缩的FLAG肽段被明确地洗脱出来，然后再1200rpm、4℃条件下回旋20min；FLAG洗脱重复一次；收集所有洗脱液，用0.45μm PVDF膜在4℃、14000rpm下旋转过滤30s；接着，将80μl HA结合的琼脂糖珠子分别用800μl HA缓冲液洗3遍，并用80μlHA缓冲液悬浮；等分的HA珠子悬浮液加入到每个FLAG洗脱液中，然后在4℃下以1200rpm轻轻涡旋过夜；每个样品用18.5μl HA缓冲液和1.5μl浓缩的HA肽段在4℃、1200rpm下特定洗脱2次；洗脱液按上述方法进行过滤，并储存于‑80℃；五、iTRAQ标记肽段的制备；四个时间点的每个冻结的蛋白质复合物洗脱物通过添加0.1wt％Rapigest SM和5mM DTT来变性和还原；溶液在60℃下孵育30min；冷却至室温后，变性的蛋白质溶液荣750ng测序级别胰酶在37℃下，充满CO2的保温箱内酶切24h；酶切后，通过添加0.5％v/v的三氟乙酸裂解Rapigest；样品接下来在充满CO2保温杯中37℃下孵育30min；Rapigest经4℃，14000rpm离心20min成丸状；去掉上清液，在反相微型洗脱96孔板进行除盐；每个孔均用400μL 40％乙腈/0.1％TFA冲洗一次，然后用2个400μL 0.1％TFA冲洗；肽段溶液被装载到准备好的孔内，用400μL 0.1％TFA洗两遍，再用两次连续的等分的50μL 40％乙腈/0.1％TFA洗脱；样品用浓缩离心机烘干，并用14μl 0.5M TEAB PH8.5缓冲液溶解；同时，准备好等份的40μl巯基琼脂糖4B珠子：通过用1ml等份的超纯去离子水清洗大约20μl干珠子5次，然后珠子用200μL 0.5M TEAB清洗一次，并重悬在40μL 0.5M TEAB中；从这个珠子储备液中，14μL分别加入四个肽段样品管内，并在室温下以1400rpm旋转1h；离心后，将上清液转移到新的EP管，弃掉珠子；接着，分别加入70μL无水乙醇，并依次各加1个iTRAQ试剂，形成每个通道反应的总体积为90μL；溶液在室温下孵育1h；样品体积通过离心浓缩机减少到30μL，然后再加入100μL 0.1％TFA进行稀释；四个样品混合在一起，用反相微型洗脱板按照上述方法进行除盐；混合的样品经离心浓缩机干燥后用65μL pH 10的20mM甲酸铵溶解；接着将样品分装成10μL等分，与开始时的2皿等量细胞相一致，并储存在‑70℃等待LC‑MS；六、LC‑MS/MS分析；七、数据处理；八、排列测验；九、Western Blotting；十、银染。