[发明专利]一种多组分Ku复合物的高效分析方法

说明书

本发明公开了一种多组分Ku复合物的高效分析方法，包括以下步骤：一、色谱柱构建；二、细胞培养和γ辐射；三、细胞核准备；所有的纯化蛋白均来自于细胞核提取物；四、FLAG‑HA示踪Ku86复合物的串联亲和纯化；五、iTRAQ标记肽段的制备；六、LC‑MS/MS分析；七、数据处理；八、排列测验；九、Western Blotting；十、银染。本发明通过比较这些分离平台分析来自细胞裂解物的复杂多肽复合物表明，RP‑RP胜于SCX‑RP主要由于其提高了一维峰容量；通过分析串联亲和纯化蛋白复合物，观察到相似的性能改进；最后，将这一系统整合到微型化的LC装置中，实现了复杂多肽和蛋白质复合物在低流速下的真实在线分离。

技术领域

本发明涉及一种分析方法，具体是一种多组分Ku复合物的高效分析方法。

背景技术

正常和畸变的生物学表型由多种蛋白质、核酸和小分子代谢物质之间的互作诱导产生。因此，所谓的系统层面的试验策略可以增加传统的基于假设的方法来描述细胞对胁迫、感染、疾病和其他生物学或环境扰动的响应。大规模蛋白质定性研究得出的数据通常滞后于依据生产量和全面性的对DNA和RNA的研究。一般而言，技术性障碍阻碍了真正的蛋白组规模的研究，主要是当下质谱分析仪有限的检测和动态范围有效性。因此，面对一个完整的蛋白质组目录下的内在困难，很多研究者选择了不是继续对蛋白质亚组或特异性转录后修饰的目标分析。轶事证据表明用于集中研究的丰富的生物材料，涵盖范围广泛的样品复杂性，经常产生超过现代质谱仪技术分析能力的蛋白质和肽段浓度检测范围。

对分析复杂生物学样品的持续不断的探索显示出LC-MS技术存在其他的分析缺陷。例如，得到普遍认可的是，尽管明确认为在典型的电喷射条件下难以定量，大量共同洗脱的肽段会竞争电荷，并有效抑制低碱度物质的检测信号。另外，尽管LC-MS/MS的工作周期正稳定提高，但经常被大量的同时递呈的分析肽段压倒。这些数据和观察值已综合催生大量的研究工作来提高肽段和蛋白质分离的峰容量，最终目的是减少LC-MS/MS单位时间内分析物的呈递数目。多维分离以最令人瞩目的方法出现，促进了对来源于生物学提取的复杂肽段混合物的深度分析。在这个方法中，每一个都基于不同的生理生化特性，两个或更多的分离方法，均利用串联来获得显著提高的峰容量。迄今为止，联合强阳离子交换(SCX)的色谱分析和反相色谱分析是利用最为广泛的系统。暂且忽略这些成功的研究案例，很明确的是，极端来看，生物复杂性常超过SCX-RP的峰容量。因此，很多其他多维分离策略，包括SAX-RP，基于凝胶的等电位聚焦耦合RP和CIEF-RP(capillary isoelectricfocusing-based)已应用于基因枪法蛋白质组学。最近，Gilar et al.引进一个分别在高PH和低PH的，基于两个阶段反相运行的多维分离平台。这一RP-RP几何结构在每一维都提供了高峰容量，然而在第一和第二阶段分别在酸性(高的缓冲液PH)和碱性(低的bufferPH)侧链接入离子对来改变PH，进而调节肽段的疏水性。不太好理解的是实现对生物学复合物样品的全波段光谱分析的多维分离的相对效益(例如，全细胞裂解物，修饰的肽段，蛋白质复合物等)。原则上，离散分析，多组分蛋白质复合物表现出与质谱分析性能相匹配的试验典范。例如，在酵母菌和人类细胞系中的大量研究表明，蛋白质复合物由平均约30个蛋白质组成，这一复杂水平非常符合LC-MS/MS分析。此外，不断完善的亲和标签库构建与机器克隆、表达和细胞培养技术的改进，为系统生产适应大规模蛋白质组学研究的试剂提供良好基础。的确，近来报道描述了新亲和标签与提高纯化蛋白质复合物的产率和特异性的相关技术的发展和应用。然而，对于随后的LC-MS的分析灵敏值仍有待探索。

发明内容

本发明的目的在于提供一种多组分Ku复合物的高效分析方法，以解决上述背景技术中提出的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种多组分Ku复合物的高效分析方法，包括以下步骤：