[发明专利]一种改进的两步酶分离培养睾丸支持细胞的方法

摘要

本发明提供一种改进的两步酶原代分离培养睾丸支持细胞的方法，包括如下步骤：选取18‑22日龄的SD雄性大鼠睾丸并去除被膜及周围结缔组织，剪碎睾丸组织，加入0.25%胰蛋白酶，在水浴锅震荡消化，离心后PBS清洗，加入0.1%的IV型胶原酶37℃水浴锅震荡消化，采用100目金属网筛过滤并收集滤液，离心弃上清，加入DMEM高糖完全培养基使细胞重悬，接种培养瓶中并置于二氧化碳培养箱中进行培养，待长满培养瓶80%进行传代培养。本发明利用0.25%胰蛋白酶与0.1%IV型胶原酶两步酶消化，缩短睾丸组织的消化时间，2min/次的37℃水浴震荡消化，使支持细胞消化彻底的同时避免细胞消化过程中损伤细胞，而且能够获得较高的支持细胞产量，获得的支持细胞活力大大提高。

主权项

1.一种改进的两步酶分离培养睾丸支持细胞的方法，其特征在于，包括如下步骤：S1：细胞分离：（1）选用18‑22日的SD大鼠睾丸，置于预先加入4~6℃预冷的无菌PBS培养皿中，清洗睾丸表面的粘液和血液，并用眼科剪和眼科镊去除睾丸被膜及睾丸实质中的血管；（2）将步骤（1）中的睾丸实质置于青霉素瓶中，加入预冷PBS，用眼科剪将睾丸实质剪碎为1~2 mm3的组织块，静置后移除上层清液；S2：细胞消化：（3）将步骤（2）中的组织块转移至15ml离心管中，加入4~5倍于组织块体积的0.25%胰蛋白酶，振荡使组织块中的曲精小管散开；（4）将步骤（3）中的离心管置于水浴锅消化直至组织块消化成线索状，加入1~2ml胎牛血清终止消化，采用1500 r/min离心5 min，移除上层清液，加入PBS缓冲液使细胞悬浮，并采用移液枪吹打悬浮细胞；（5）对步骤（4）的离心管采用1000 r/min离心5 min，移除上层清液后加入3~4倍于组织块体积的0.1％IV型胶原酶，置于水浴锅中消化直至组织块变成粘液状，加入DMEM高糖完全培养基终止消化；（6）将经步骤（5）消化的组织块过滤后收集过滤液于离心管中，采用800 r/min离心5 min后移除上层清液，获得睾丸支持细胞；S3：细胞培养：（7）采用DMEM高糖完全培养基重悬睾丸支持细胞，采用细胞计数仪进行细胞计数并将细胞浓度调整为（0.5~1）×106/mL，接种于25cm2培养瓶中，使细胞分散均匀后置于二氧化碳培养箱中培养；S4：细胞纯化：（8）培养24 h在显微镜下观察，在室温条件下的使用PBS洗涤，更换37℃预热的，分离培养的72 h内，每隔24h换一次新的培养基，待细胞长至培养瓶的85‑95%时进行细胞传代。