[发明专利]一种改进的两步酶分离培养睾丸支持细胞的方法

权利要求书

1.一种改进的两步酶分离培养睾丸支持细胞的方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1：细胞分离：

（1）选用18-22日的SD大鼠睾丸，置于预先加入4~6℃预冷的无菌PBS培养皿中，清洗睾丸表面的粘液和血液，并用眼科剪和眼科镊去除睾丸被膜及睾丸实质中的血管；

（2）将步骤（1）中的睾丸实质置于青霉素瓶中，加入预冷PBS，用眼科剪将睾丸实质剪碎为1~2 mm³的组织块，静置后移除上层清液；

S2：细胞消化：

（3）将步骤（2）中的组织块转移至15ml离心管中，加入4~5倍于组织块体积的0.25%胰蛋白酶，振荡使组织块中的曲精小管散开；

（4）将步骤（3）中的离心管置于水浴锅消化直至组织块消化成线索状，加入1~2ml胎牛血清终止消化，采用1500 r/min离心5 min，移除上层清液，加入PBS缓冲液使细胞悬浮，并采用移液枪吹打悬浮细胞；

（5）对步骤（4）的离心管采用1000 r/min离心5 min，移除上层清液后加入3~4倍于组织块体积的0.1％IV型胶原酶，置于水浴锅中消化直至组织块变成粘液状，加入DMEM高糖完全培养基终止消化；

（6）将经步骤（5）消化的组织块过滤后收集过滤液于离心管中，采用800 r/min离心5min后移除上层清液，获得睾丸支持细胞；

S3：细胞培养：

（7）采用DMEM高糖完全培养基重悬睾丸支持细胞，采用细胞计数仪进行细胞计数并将细胞浓度调整为（0.5~1）×10⁶/mL，接种于25cm²培养瓶中，使细胞分散均匀后置于二氧化碳培养箱中培养；

S4：细胞纯化：

（8）培养24 h在显微镜下观察，在室温条件下的使用PBS洗涤，更换37℃预热的，分离培养的72 h内，每隔24h换一次新的培养基，待细胞长至培养瓶的85-95%时进行细胞传代。

2.根据权利要求1所述的改进的两步酶分离培养睾丸支持细胞的方法，其特征在于，步骤（2）中在青霉素瓶中剪碎睾丸组织块，预冷PBS添加量为3~4ml，预冷温度为4~6℃。

3.根据权利要求1所述的改进的两步酶分离培养睾丸支持细胞的方法，其特征在于，步骤（2）中，静置时间为3~5min，所述上层清液采用规格1ml的移液枪移除。

4.根据权利要求1所述的改进的两步酶分离培养睾丸支持细胞的方法，其特征在于，步骤（4）中水浴锅消化温度37℃，消化时间为12~15min，消化期间每隔2min震荡离心管一次；所述PBS缓冲液添加量为10ml。

5.根据权利要求1所述的改进的两步酶分离培养睾丸支持细胞的方法，其特征在于，步骤（5）中水浴锅消化温度37℃，消化时间为8~10min，消化期间每隔2min震荡离心管一次。

6.根据权利要求1所述的改进的两步酶分离培养睾丸支持细胞的方法，其特征在于，步骤（6）中所述组织块采用100目金属网筛进行过滤。

7.根据权利要求1所述的改进的两步酶分离培养睾丸支持细胞的方法，其特征在于，步骤（7）中，所述DMEM高糖完全培养基包括100IU/ml青霉素、100ug/ml链霉素以及10%FBS；所述二氧化碳培养箱的培养环境为37℃、5%CO₂以及饱和湿度。