[发明专利]一种改进的两步酶分离培养睾丸支持细胞的方法

说明书

本发明提供一种改进的两步酶原代分离培养睾丸支持细胞的方法，包括如下步骤：选取18‑22日龄的SD雄性大鼠睾丸并去除被膜及周围结缔组织，剪碎睾丸组织，加入0.25%胰蛋白酶，在水浴锅震荡消化，离心后PBS清洗，加入0.1%的IV型胶原酶37℃水浴锅震荡消化，采用100目金属网筛过滤并收集滤液，离心弃上清，加入DMEM高糖完全培养基使细胞重悬，接种培养瓶中并置于二氧化碳培养箱中进行培养，待长满培养瓶80%进行传代培养。本发明利用0.25%胰蛋白酶与0.1%IV型胶原酶两步酶消化，缩短睾丸组织的消化时间，2min/次的37℃水浴震荡消化，使支持细胞消化彻底的同时避免细胞消化过程中损伤细胞，而且能够获得较高的支持细胞产量，获得的支持细胞活力大大提高。

技术领域

本发明属于分离原代细胞领域，具体涉及一种改进的两步酶分离培养睾丸支持细胞的方法。

背景技术

多年来支持细胞的功能被认为是生精细胞的支架,，为生精细胞提供必需的营养物质, 能合成与分泌雄激素结合蛋白(androgen binding protein, ABP)，为生精细胞提供高浓度的雄激素环境等。睾丸支持细胞紧密连接参与构成的血-生精小管屏障，可阻止某些物质进出生精上皮，形成并维持有利于精子发生的微环境，还能防止精子抗原物质逸出到生精小管外而发生自体免疫反应。近年来支持细胞生物学特性的研究揭示了支持细胞还能分泌多种物质，而且众多研究者在支持细胞的应用性方面开始进行探索。睾丸支持细胞在体外可促进神经元以及胰岛细胞的存活及功能，为糖尿病和帕金森病的治疗开辟了广阔的前景。近年还报道了睾丸支持细胞用于体细胞克隆的可能性。所有这些说明睾丸支持细胞的功能非常广泛，应用前景广大，其具体的作用机制以及更广泛的应用有待于进一步开发。在分离培养支持细胞中，选择合适的试验动物是分离培养支持细胞的基础，而SD大鼠是试验中常用的试验动物，其遗传稳定，而且经济实用，处理容易，而且大鼠属于哺乳动物。随着目前对支持细胞的研究越来越深入，支持细胞在临床研究也有重要的作用，因此分离出数量多，纯度高的支持细胞方法是研究支持细胞的生物学应用的基础。

大鼠睾丸组织结构是由8大部分构成：即鞘膜脏层、白膜、睾丸隔膜、睾丸纵隔、间质细胞、直精小管和睾丸网、生精小管，生精小管由支持细胞和生精细胞构成。因此支持细胞的分离纯化过程中，从大鼠日龄的选择到睾丸支持细胞分离和纯化，对每一个步骤都要求很高，其中任何一个因素都可能影响支持细胞的数量和纯度。尤其是分离两步酶消化的过程中，如果酶消化时间过长可能导致细胞消化过度，得到的细胞数量较少；如果消化时间较短可能会使支持细胞消化不彻底，得到的细胞纯度低，因此在分离过程中对酶消化的时间要求很严格。

发明内容

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种改进的两步酶分离培养睾丸支持细胞的方法。

为了实现上述目的或者其他目的，本发明是通过以下技术方案实现：

一种改进的两步酶分离培养睾丸支持细胞的方法，包括如下步骤：

S1：细胞分离：

（1）选用18-22日的SD大鼠睾丸，置于预先加入4~6℃预冷的无菌PBS培养皿中，清洗睾丸表面的粘液和血液，并用眼科剪和眼科镊去除睾丸被膜及睾丸实质中的血管；；

（2）将步骤（1）中的睾丸实质置于青霉素瓶中，加入预冷PBS，用眼科剪将睾丸实质剪碎为1~2 mm³的组织块，静置后移除上层清液；

S2：细胞消化：

（3）将步骤（2）中的组织块转移至15ml离心管中，加入4~5倍于组织块体积的0.25%胰蛋白酶，振荡使组织块中的曲精小管散开；

（4）将步骤（3）中的离心管置于水浴锅消化直至组织块消化成线索状，加入1~2ml胎牛血清终止消化，采用1500 r/min离心5 min，移除上层清液，加入PBS缓冲液使细胞悬浮，并采用移液枪吹打悬浮细胞；