[发明专利]一种单克隆细胞培养方法

摘要

本申请属于单克隆细胞培养技术领域，具体涉及一种利用基因编辑技术构建稳定表达细胞系过程中的单克隆细胞培养方法专利申请事宜。该方法以CRISPR/Cas9基因编辑技术为基础，具体包括：利用CRISPR/Cas9技术对基因组进行编辑，利用3D软纤维蛋白基质胶对筛选所得细胞进行培养等步骤。总体而言，本发明将优化后的3D软纤维蛋白基质胶培养条件用于构建单克隆细胞群，大大提高了单细胞的存活率，从而快速筛选出基因修饰一致的，遗传背景完全一样的稳定转染细胞系。特别对于那些普通培养方法难以生长的细胞，具有明显的优势，从而有利于后续实验的进行。

主权项

一种单克隆细胞培养方法，其特征在于，该方法具体包括如下操作步骤：（一）按现有技术，利用CRISPR/Cas9技术对基因组进行编辑，将CRISPER‑Cas9 质粒转染待编辑的细胞，通过流式分选出目的细胞；（二）利用3D软纤维蛋白基质胶对步骤（一）中筛选所得细胞进行培养，具体操作步骤参考如下：（1）用培养基稀释步骤（一）中筛选所得目的细胞，保证后续铺板时孔板每个孔内为单个细胞；（2）在步骤（1）中稀释后体系中加入纤维蛋白原、T7缓冲液和培养基，混匀后置于冰上待用；纤维蛋白原浓度以20mg/mL计，以96孔板计，每孔中纤维蛋白原加入量为2~3μL，；（3）在预冷的孔板上先加入凝血酶，然后加入步骤（2）中的混合体系，混匀后均匀铺满板底；（4）将步骤（3）中孔板置于培养箱中培养 40~60min，补充培养基后，继续培养5~8d；（5）培养结束后，将步骤（4）中的培养物捣碎，加入分散酶 II，以使混合物充分溶解；（6）将步骤（5）中溶解后混合物离心，弃上清，并用PBS清洗；（7）在步骤（6）的沉淀中加入胰蛋白酶‑EDTA消化液分散细胞和培养基，混匀后继续培养；（8）对步骤（7）中培养细胞培养12~16d后，进一步扩大培养。