[发明专利]一种单克隆细胞培养方法

说明书

本申请属于单克隆细胞培养技术领域，具体涉及一种利用基因编辑技术构建稳定表达细胞系过程中的单克隆细胞培养方法专利申请事宜。该方法以CRISPR/Cas9基因编辑技术为基础，具体包括：利用CRISPR/Cas9技术对基因组进行编辑，利用3D软纤维蛋白基质胶对筛选所得细胞进行培养等步骤。总体而言，本发明将优化后的3D软纤维蛋白基质胶培养条件用于构建单克隆细胞群，大大提高了单细胞的存活率，从而快速筛选出基因修饰一致的，遗传背景完全一样的稳定转染细胞系。特别对于那些普通培养方法难以生长的细胞，具有明显的优势，从而有利于后续实验的进行。

技术领域

本申请属于单克隆细胞培养技术领域，具体涉及一种利用基因编辑技术构建稳定转染细胞系过程中的单克隆细胞培养方法专利申请事宜。

背景技术

由单个细胞繁衍所形成的细胞群称之为单克隆细胞群，即：将一个细胞进行培养，使之不断分裂形成一个细胞群的过程，这一群细胞来源于共同的祖先细胞。随着利用慢病毒转染技术构建稳定表达细胞系，以及基因编辑技术的普及，使得单克隆细胞群构建方法也得到了发展，尤其在肿瘤相关研究中，如何获得性状单一、稳定的细胞株尤为重要。

慢病毒属于逆转录病毒科，是一种RNA病毒，其中最为人所知的是人类免疫缺陷病毒(HIV-1)。HIV-1 直径约120nm，含两条正链 RNA，可有效的进入细胞核中，对分裂期细胞及非分裂期细胞均具有很高的感染效率。慢病毒感染细胞后可将所携带的基因整合到细胞基因组中，并且长时间持续稳定表达，同时能够随细胞分裂稳定遗传下去，因此成为导入外源基因的有效工具。

慢病毒载体是以 HIV-1 为基础改造获得的基因治疗载体，通过去除致病基因，同时减少辅助质粒与载体质粒的同源性，使慢病毒具有了滴度更高、生物安全性更好、导入外源片段的能力更强等特性。目前慢病毒系统已经广泛应用到基因过表达、RNA 干扰、miRNA研究及基因敲除等功能研究的细胞和动物实验中。

基因编辑是指对基因组进行定点修饰的一项新技术。利用该技术，可以精确地定位到基因组的某一位点上，在这位点上剪断靶标DNA 片段并插入新的基因片段。目前主要有三种基因编辑技术：重组锌指核酸酶（zinc finger nuclease，ZFN）、转录激活因子样效应蛋白核酸酶（transcription activator-like effector nuclease，TALEN）以及RNA引导的CRISPR/Cas核酸酶技术(CRISPR-Cas RGNs)。其中CRISPR-Cas RGNs技术中的CRISPR/Cas9基因编辑技术由于其操作简单、效率高、成本低等优点，被得到广泛应用。简单来说，CRISPR/Cas9(CRISPR-associated 9)是一种由向导RNA(guide RNA，gRNA)指导Cas核酸酶9对靶向基因进行特定DNA修饰的技术，可以对基因组特定位点进行靶向编辑，包括缺失、插入、修复等操作。

一般而言，利用慢病毒转染系统以及基因编辑技术构建稳定表达细胞系操作过程中，需要培养单个细胞，而这种操作一般在96孔板上采用有限稀释法进行培养筛选。但实际操作过程中，受限于细胞类型或细胞活力等因素影响，对96孔板上部分稀释后细胞培养时，存在有的单个细胞几乎不生长、细胞一直未分裂，或者存活的单个细胞极少等问题，需要铺多个96孔板进行培养才能进行后续筛选操作的缺陷，这些缺陷或者严重影响后续实验操作，或者导致筛选结果的不稳定，因此对于单细胞的培养体系极有必要进一步改进。

发明内容

针对现有利用慢病毒转染系统以及基因编辑技术构建稳定表达细胞系过程中的部分问题，本申请目的在于提供一种更方便、更效率的单克隆细胞培养技术，以便筛选到基因修饰一致、遗传背景一样的稳定转染细胞系。

本申请所采取的技术方案详述如下。

一种单克隆细胞培养方法，该方法以CRISPR/Cas9基因编辑技术为基础，具体包括如下操作步骤：

（一）按现有技术，利用CRISPR/Cas9技术对基因组进行编辑，将CRISPER-Cas9 质粒转染待编辑的细胞；