[发明专利]热稳定的Cas9核酸酶在审
| 申请号： | 201780086546.5 | 申请日： | 2017-12-14 |
| 公开（公告）号： | CN110431229A | 公开（公告）日： | 2019-11-08 |
| 发明（设计）人： | 约翰·万德奥斯特;理查德·范克拉嫩堡;艾勒克·芬纳·博斯马;扬尼斯·莫加科斯;普拉塔纳·莫汉拉朱 | 申请（专利权）人： | 瓦赫宁根大学;科学技术基金会 |
| 主分类号： | C12N9/22 | 分类号： | C12N9/22;C12N15/113;C12N15/90 |
| 代理公司： | 北京安信方达知识产权代理有限公司 11262 | 代理人： | 李敏春;郑霞 |
| 地址： | 荷兰瓦*** | 国省代码： | 荷兰;NL |
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| 摘要： | 编码来自热脱氮地芽孢杆菌(Geobacillus thermodenitrificans)的ThermoCas9蛋白的多核苷酸和组成型启动子被用于工程化真核细胞，例如真菌、酵母或藻类，使得ThermoCas9核酸内切酶被整合并从细胞的基因组表达。然后，使用第二表达质粒转染这些表达ThermoCas9的细胞，第二质粒包含诱导型启动子和编码指导RNA(guide RNA)的多核苷酸。指导RNA与ThermoCas9组合，以提供靶向的核酸内切酶活性，以在期望的基因座或感兴趣的基因处裂解细胞DNA。还向细胞提供了修复寡聚物，由此在DNA裂解后，同源重组发生在具有修复寡聚物的细胞中，使得在感兴趣的基因座或基因中实现核苷酸的缺失或取代。描述了表达载体和使用所述载体以实现ThermoCas9介导的基因编辑的方法，由此使用更高的温度，例如大于30℃。 | ||
| 搜索关键词： | 细胞 多核苷酸 寡聚物 基因座 基因 核酸内切酶活性 诱导型启动子 组成型启动子 地芽孢杆菌 核酸酶编码 核酸内切酶 基因组表达 修复 表达载体 表达质粒 裂解细胞 同源重组 真核细胞 工程化 核苷酸 热稳定 真菌 靶向 介导 裂解 脱氮 整合 质粒 转染 酵母 藻类 蛋白 期望 | ||
【主权项】：
1.一种修饰真核细胞的遗传物质的方法，所述方法包括(i)将在第一启动子的控制下编码ThermoCas9的多核苷酸整合到所述细胞的基因组中，其中所表达的ThermoCas9包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列或与SEQ ID NO:1具有至少77％同一性的序列，或其活性片段；(ii)用表达载体转化所述细胞，所述表达载体包含编码指导RNA并且在第二启动子的控制下的多核苷酸序列，其中所述指导RNA具有识别在所述细胞的基因组中在期望的靶基因座处包含的核酸序列的核酸序列，和(iii)用修复寡核苷酸转化所述细胞。
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