[发明专利]一种玫瑰石斛组织培养扩繁的方法

摘要

本发明公开了一种玫瑰石斛组织培养扩繁的方法，包括外植体选择步骤、外植体消毒步骤、播种步骤、继代培养步骤、生根培养步骤和炼苗、驯化移栽步骤。本发明的方法能够有效的提高玫瑰石斛种苗的繁育的速度及繁育数量，从母本源头控制种质的稳定性，保证种苗质量，实现玫瑰石斛优质种子种苗的工厂化生产，满足生产需求，缓解资源稀缺的现况。 1

主权项

1.一种玫瑰石斛组织培养扩繁的方法，其特征在于包括：

外植体选择步骤：选择玫瑰石斛母本植株，对其人工授粉，让其长出果荚，继续培育，待果荚成熟后，将其采摘保存；

外植体消毒步骤：取出果荚放入培养瓶中，先洁净果荚，然后对果荚外壳进行一次消毒1‑2min，然后用无菌水冲洗3‑4次，再进行二次消毒6‑8min，然后用无菌水冲洗4‑5次，备用；

播种步骤：将消毒后的果荚解剖开露出黄色果粉，将果粉撒到第一1/2MS培养基上，封上培养瓶的瓶盖，培养至种子萌发；

继代培养步骤：萌发的玫瑰石斛种子继续培养，玫瑰石斛种苗长到2‑3cm高时称之为一级母瓶，此时将一级母瓶在无菌操作台上转到第二1/2MS培养基中，长至5‑6cm时称为二级母瓶；

生根培养步骤：将二级母瓶转至MS培养基中，生根培养得到生根瓶苗；

炼苗、驯化移栽步骤：将生根瓶苗培养85‑95天，再将其移到避免强光直射的室外环境中，放置15‑30天，再打开培养瓶的瓶盖放置3‑5天后，用多菌灵稀释液浸泡玫瑰石斛苗根部，洗净阴干水分，将其移栽到基质中驯化。

2.如权利要求1所述的玫瑰石斛组织培养扩繁的方法，其特征在于：外植体选择步骤中，选择玫瑰石斛2‑4年的母本植株，在玫瑰石斛开花期间对其人工授粉，让其长出果荚，继续培育3‑4个月，待果荚成熟后，将其采摘放置在3‑7℃的环境下保存1‑3周。

3.如权利要求1所述的玫瑰石斛组织培养扩繁的方法，其特征在于：外植体消毒步骤中，洁净果荚的具体步骤为，先将果荚用洗洁精水浸泡15‑20min，用毛刷刷净种壳表面，并用自来水冲洗10‑15min，然后将果荚用浓度75％医用酒精浸泡30‑60s，无菌水冲洗3‑4次，再进行消毒；用浓度为1‑3％的次氯酸钠进行一次消毒，用浓度为0.1‑0.3％的氯化汞进行二次消毒。

4.如权利要求1所述的玫瑰石斛组织培养扩繁的方法，其特征在于：播种步骤中，第一1/2MS培养基的成分包括1890‑1900mg/L硝酸钾，1640‑1650mg/L硝酸铵，440‑445mg/L二水氯化钙，370‑375mg/L七水硫酸镁，160‑170mg/L磷酸二氢钾，0.8‑0.83mg/L碘化钾，6.0‑6.2mg/L硼酸，22.3‑23.0mg/L四水硫酸锰，8.6‑9.0mg/L七水硫酸锌，0.2‑0.25mg/L钼酸钠，0.025‑0.028mg/L五水硫酸铜，0.028‑0.03mg/L氯化钴，27.5‑29mg/L硫酸亚铁，23‑25mg/L乙二胺四乙酸，96‑100mg/L肌醇，0.2‑0.3mg/L烟酸，0.25‑0.35mg/L盐酸硫胺素，0.2‑0.3mg/L盐酸吡哆锌，0.8‑0.9mg/L甘氨酸，浓度为2％‑3％的蔗糖和4.8‑6.0g/L琼脂粉，pH调至5.8‑6.2。

5.如权利要求1所述的玫瑰石斛组织培养扩繁的方法，其特征在于：播种步骤中，培养25‑30天至种子萌发，培养的条件为，温度为24℃‑26℃，光照强度为2000‑2500lx，光照时间为10‑12小时/天。

6.如权利要求1所述的玫瑰石斛组织培养扩繁的方法，其特征在于：继代培养具体为，萌发的玫瑰石斛种子置于光照强度为2000‑2500lx的培养室中继续培养40‑50天，光照时间为10‑12小时/天，玫瑰石斛种苗长到2‑3cm高时称之为一级母瓶，此时将一级母瓶在无菌操作台上转到第二1/2MS培养基中，培养55‑65天，长至5‑6cm时称为二级母瓶。

7.如权利要求6所述的玫瑰石斛组织培养扩繁的方法，其特征在于：继代培养步骤中，第二1/2MS培养基的成分包括1890‑1900mg/L硝酸钾，1640‑1650mg/L硝酸铵，440‑445mg/L二水氯化钙，370‑375mg/L七水硫酸镁，160‑170mg/L磷酸二氢钾，0.8‑0.83mg/L碘化钾，6.0‑6.2mg/L硼酸，22.3‑23.0mg/L四水硫酸锰，8.6‑9.0mg/L七水硫酸锌，0.2‑0.25mg/L钼酸钠，0.025‑0.028mg/L五水硫酸铜，0.028‑0.03mg/L氯化钴，27.5‑29mg/L硫酸亚铁，23‑25mg/L乙二胺四乙酸，96‑100mg/L肌醇，0.2‑0.3mg/L烟酸，0.25‑0.35mg/L盐酸硫胺素，0.2‑0.3mg/L盐酸吡哆锌，0.8‑0.9mg/L甘氨酸，0.5‑0.8mg/L萘乙酸，1.2‑1.5mg/L6‑苄基腺嘌呤，浓度为2％‑3％的蔗糖，4.8‑6.0g/L琼脂粉，35‑40g/L土豆汁和0.1‑0.3g/L活性碳粉，pH调至5.8‑6.0。

8.如权利要求1所述的玫瑰石斛组织培养扩繁的方法，其特征在于：生根培养具体为，将生长45‑55天的二级母瓶在无菌操作台上转至MS培养基中，生根培养85‑95天，得到生根瓶苗。

9.如权利要求8所述的玫瑰石斛组织培养扩繁的方法，其特征在于：生根培养步骤中，MS培养基的成分包括3790‑3800mg/L硝酸钾，3290‑3300mg/L硝酸铵，870‑880mg/L二水氯化钙，730‑740mg/L七水硫酸镁，330‑340mg/L磷酸二氢钾，1.62‑1.66mg/L碘化钾，12.0‑12.44mg/L硼酸，44.6‑46mg/L四水硫酸锰，17.2‑18mg/L七水硫酸锌，0.4‑0.5mg/L钼酸钠，0.05‑0.06mg/L五水硫酸铜，0.05‑0.06mg/L氯化钴，55‑58mg/L硫酸亚铁，46‑50mg/L乙二胺四乙酸，192‑200mg/L肌醇，0.4‑0.6mg/L烟酸，0.5‑0.7mg/L盐酸硫胺素，0.4‑0.6mg/L盐酸吡哆锌，1.6‑1.8mg/L甘氨酸，1.6‑2.0mg/L萘乙酸，0.3‑0.6mg/L6‑苄基腺嘌呤，浓度为2％‑3％的蔗糖，4.8‑6.0g/L琼脂粉，35‑40g/L土豆汁，25‑35g/L香蕉汁和0.1‑0.3g/L活性碳粉，pH调至5.8‑6.0。

10.如权利要求1所述的玫瑰石斛组织培养扩繁的方法，其特征在于：炼苗、驯化移栽步骤中，将生根瓶苗培养85‑95天的具体步骤为，瓶苗在培养室长至55‑65天后，将其移至温度为22‑28℃、湿度为45％‑75％的大棚中炼苗20‑40天。