[发明专利]一种转录因子免疫共沉淀（ChIP）试剂配方

摘要

本发明涉及一种转录因子免疫共沉淀(ChIP)试剂配方，包括甲醛交联、超声波破碎，免疫沉淀，洗脱、解交联，纯化富集DNA片段。该试剂配方采用甲醛固定活细胞和组织的方法，能比较真实的反映细胞内TF与Promoter的结合情况，有体外研究核酸与蛋白相互结合的实验方法所不能比拟的优势。

主权项

1.一种转录因子免疫共沉淀(ChIP)试剂配方，其特征在于，该配方包括以下处理步骤：步骤一：甲醛交联：在收集的组织样本中加入甲醛溶液，使得甲醛的终浓度为1wt％；37℃孵育10min后，再加入甘氨酸终止交联，使得甘氨酸的终浓度为125mM；37℃静置10min后用PBS缓冲液洗涤两遍；所述PBS缓冲液包括：200mM NaCl、3mM KCl、1mM CaCl2、1mM MgCl2、10mM Na2HPO4、1mM KH2PO4，所述PBS缓冲液的PH值为7.3；加入提取缓冲液A，在4℃下匀浆10000g中离心20min，去除上层清液；所述提取缓冲液A包括：10mM Tris‑HCl、400mM蔗糖、0.1mMβ‑ME、0.1mM PMSF和蛋白酶抑制剂；所述蛋白酶抑制剂包括AEBSF、Aprotinin、Bestatin、E‑64、Leupeptin、Pepstatin A；加入提取缓冲液B，在4℃下匀浆10000g中离心40min，去除上层清液；所述提取缓冲液B包括：10mM Tris‑HCl、0.6mM蔗糖、0.1mMβ‑ME、0.1mM PMSF、10mM MgCl2、1wt％TritonX‑100和所述蛋白酶抑制剂；加入提取缓冲液C，在4℃下匀浆15000g中离心60min，去除上层清液；所述提取缓冲液C包括：10mM Tris‑HCl、800mM蔗糖、0.1mMβ‑ME、0.1mM PMSF、10mM MgCl2、2wt％Triton X‑100和所述蛋白酶抑制剂；步骤二：超声波破碎：用超声波处理步骤一的产物，将DNA剪切成200～1000bp的片段；步骤三：免疫沉淀：将蛋白A琼脂糖珠用稀释缓冲液洗涤三次后重悬于所述稀释缓冲液中得到混合液A；所述稀释缓冲液包括：15mM Tris‑HCl、0.1mM EDTA、0.1mM PMSF、150mM NaCl、2wt％Triton X‑100和所述蛋白酶抑制剂；所述混合液A包括所述蛋白A琼脂糖珠和所述稀释缓冲液；将步骤二的产物在4℃下匀浆10000g中离心20min，去除不溶物质；再加入所述混合液A，在4℃下轻轻晃动2h，在4℃下匀浆10000g中离心20min，除去上层清液，收集免疫沉淀；步骤四：洗脱：用洗脱液A洗涤所述免疫沉淀10min，在4℃下匀浆15000g中离心10min，取沉淀物；所述洗脱液A包括：15mM Tris‑HCl、2mM EDTA、150mM NaCl、1wt％Triton X‑100、1wt％SDS；用洗脱液B洗涤10min，在4℃下匀浆15000g中离心10min，取沉淀物；所述洗脱液B包括：15mM Tris‑HCl、2mM EDTA、500mM NaCl、1wt％Triton X‑100、1wt％SDS；用洗脱液C洗涤10min，在4℃下匀浆15000g中离心10min，取沉淀物；所述洗脱液C的成分包括：15mM Tris‑HCl、2mM EDTA、200mM LiCl、1wt％NP‑40、1wt％脱氧胆酸钠；步骤五：解交联：加入NaCl溶液，使得NaCl的终浓度为0.2mM，65℃孵育过夜；步骤六：纯化富集DNA片段：加入纯化液,65℃温育1h，所述纯化液包括：1000mM Tris‑HCl、500mM EDTA、10mg/ml蛋白酶K；加入等体积的氯仿醇溶液，温和混匀后静置10min，取上层清液；所述氯仿醇溶液包括：Tris饱和酚、氯仿、异戊醇，体积比为25:24:1；加入两倍体积的无水乙醇沉淀后得到纯化DNA。