[发明专利]一种用于检测甲型肝炎病毒滴度的细胞系及其构建方法与应用

摘要

本发明涉及一种用于检测甲型肝炎病毒滴度的细胞系及其构建方法与应用。本发明利用3ABC蛋白酶能与MAVS相互的性质，将MAVS C端与荧光蛋白构建融合蛋白，并将其包装成慢病毒颗粒，感染细胞后，表达的融合蛋白会锚定在细胞质中的线粒体上成点状分布，在嘌呤霉素筛选下，可得到稳定表达融合蛋白的稳定细胞系，当此细胞系被HAV感染后荧光蛋白会弥散在整个细胞或定位到细胞核中，在甲基纤维素存在下，可观察到荧光噬斑，通过计算噬斑数可检测HAV的感染性滴度。与传统方法相比，本发明方法检测HAV滴度仅需要1‑4天，显著缩短了的病毒检测周期，而且操作简单、灵敏度较高，可以直接观察到HAV的感染过程，易于推广应用。

主权项

一种用于检测甲型肝炎病毒滴度的细胞系的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤（1），质粒构建：以Huh7.0细胞或树鼩肝脏中的总RNA为模板，采用RT‑PCR扩增MAVS C末端基因序列MAVS，并对扩增产物和慢病毒表达载体进行双酶切，然后通过T4连接酶对双酶切后扩增产物和慢病毒表达载体通过T4连接酶进行连接，得到重组质粒；所述的MAVS C末端氨基酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示；所述的慢病毒表达载体为LV‑荧光蛋白‑IRES‑PURO‑WPRE载体；步骤（2），慢病毒包装：将步骤（1）得到的重组质粒与pMD2.G、SPAX2质粒一起采用脂质体的方法共转染293T细胞中，制得慢病毒；步骤（3），稳定细胞系构建：将步骤（2）制得的慢病毒感染Huh7.0细胞，接着将表达荧光融合蛋白的Huh7.0细胞系扩大培养，之后通过嘌呤霉素筛选表达荧光融合蛋白的Huh7.0细胞系，得到用于检测甲型肝炎病毒的细胞系。