[发明专利]一种用于检测甲型肝炎病毒滴度的细胞系及其构建方法与应用

说明书

本发明涉及一种用于检测甲型肝炎病毒滴度的细胞系及其构建方法与应用。本发明利用3ABC蛋白酶能与MAVS相互的性质，将MAVS C端与荧光蛋白构建融合蛋白，并将其包装成慢病毒颗粒，感染细胞后，表达的融合蛋白会锚定在细胞质中的线粒体上成点状分布，在嘌呤霉素筛选下，可得到稳定表达融合蛋白的稳定细胞系，当此细胞系被HAV感染后荧光蛋白会弥散在整个细胞或定位到细胞核中，在甲基纤维素存在下，可观察到荧光噬斑，通过计算噬斑数可检测HAV的感染性滴度。与传统方法相比，本发明方法检测HAV滴度仅需要1‑4天，显著缩短了的病毒检测周期，而且操作简单、灵敏度较高，可以直接观察到HAV的感染过程，易于推广应用。

技术领域

本发明属于医学生物学检测技术领域，具体涉及一种用于定性和定量检测甲型肝炎病毒滴度的细胞系及其构建方法与应用。

背景技术

甲型肝炎病毒(Hepatitis A virus，HAV)感染被认为是一个非常重要的公共卫生问题。在发展中或发达国家，HAV是引起急性肝炎及部分急性肝功能衰竭的主要病原体之一。据统计，全世界每年大约有140万例甲型肝炎病毒感染。由于甲型肝炎减毒活疫苗与灭活疫苗的相继使用，目前，甲型肝炎病毒的传播已得到了有效的控制。

甲型肝炎病毒是一种正链RNA病毒，属于微小RNA病毒科肝病毒属。HAV感染细胞后不会产生细胞病变效应，这就为观察和检测HAV感染带来了一定的难度。目前，一般采用免疫荧光、ELISA、RT-PCR、组织培养半数感染量(CCID50)等方法对HAV滴度及食品中的HAV进行检测。ELSA法主要检测HAV的抗原，不能完全体现HAV活病毒颗粒数，而且灵敏度也较差；组织培养半数感染量(CCID50)可以检测活病毒数，但检测周期较长需要21-28天；RT-PCR法通过对HAV基因的目标片段进行扩增检测，具有简单和灵敏度高的特点，但是此种方法不能区分感染性与非感染性病毒颗粒数。因此如何克服现有技术的不足是目前医学检测技术领域亟需解决的问题。

发明内容

为解决甲型肝炎病毒感染性滴度检测耗时较长、操作复杂繁琐等问题，本发明的目的是提供一种快速、简单、准确的定性和定量检测甲型肝炎病毒滴度的细胞系及其构建方法与应用。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

一种用于检测甲型肝炎病毒滴度的细胞系的构建方法，包括如下步骤：

步骤(1)，质粒构建：

以Huh7.0细胞或树鼩肝脏中的总RNA为模板，采用RT-PCR扩增MAVS C末端基因序列MAVS，并对扩增产物和慢病毒表达载体进行双酶切，然后通过T4连接酶对双酶切后扩增产物和慢病毒表达载体通过T4连接酶进行连接，得到重组质粒LV-荧光蛋白-MAVS(C-terminal)-IRES-PURO-WPRE；

所述的MAVS C末端氨基酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示；

所述的慢病毒表达载体为LV-荧光蛋白-IRES-PURO-WPRE载体；

步骤(2)，慢病毒包装：

将步骤(1)得到的重组质粒与pMD2.G、SPAX2质粒一起采用脂质体的方法共转染293T细胞中，制得慢病毒；

步骤(3)，稳定细胞系构建：

将步骤(2)制得的慢病毒感染Huh7.0细胞，接着将表达荧光融合蛋白的Huh7.0细胞系扩大培养，之后通过嘌呤霉素筛选表达荧光融合蛋白的Huh7.0细胞系，得到用于检测甲型肝炎病毒的细胞系。

进一步，优选的是，所述的荧光蛋白为EGFP或mCherry。