[发明专利]一种脾氨肽内游离氨基酸的测定方法

摘要

本发明公开了一种脾氨肽内游离氨基酸的测定方法，包括步骤一，溶液配制，配制对照品储备液、内标储备液、流动相A、流动相B；步骤二，样品处理；步骤三，柱前衍生；步骤四，色谱分离，进样，梯度洗脱，检测波长依次为338nm、262nm，测出峰面积；步骤五，游离氨基酸含量计算。本发明具有以下优点和效果采用柱前衍生的液相色谱，样品经过衍生后进样，通过色谱分离时的梯度洗脱，将脾氨肽内的游离氨基酸依次洗脱下来；通过选用氨基酸标准品进行色谱洗脱，计算出以溶液质量浓度X对峰面积Y进行线性回归，计算出线性回归方程，再根据峰面积计算出脾氨肽内的游离氨基酸含量，测定结果准确性高，便于控制脾氨肽制品的含量。

主权项

一种脾氨肽内游离氨基酸的测定方法，其特征在于，包括以下步骤步骤一，溶液配制，精密称取多种氨基酸标准品及氨基葡萄糖对照品，用HCl溶液稀释后，配制成对照品储备液；内标储备液，称取L‑2氨基酸，溶于HCl溶液，配制成内标储备液；硼酸盐缓冲液，称取硼酸和氢氧化钠，溶于水后，用氢氧化钠溶液调节pH至10.2；邻苯二甲醛衍生试剂，称取邻苯二甲醛，加入硼酸盐缓冲液溶解，加入3‑巯基丙酸，再用硼酸盐缓冲液稀释，超声溶解；9‑芴甲基氯甲酸酯衍生试剂，称取9‑芴甲基氯甲酸酯，用乙腈溶解；流动相A，磷酸氢二钠与硼酸钠缓冲液；流动相B，以体积比计，包括45份乙腈、45份甲醇、10份水；进样溶剂，包括流动相A和磷酸；步骤二，样品处理，取脾氨肽原液，加入介孔二氧化硅微球，振荡均匀后，静置30‑50分钟，介孔二氧化硅微球孔径范围在7‑11nm，粒径在1.0‑1.5μm之间，介孔二氧化硅微球上负载有铁粒子；超声波处理0.5‑1min，频率在21000‑23000HZ之间，用孔径为0.8μm的有机膜过滤；向滤液中加入内标储备液、HCl溶液，混合，真空下封口，在100℃水解24小时，冷却后开口，将水解液转移到蒸发皿，减压干燥后，加入蒸馏水，蒸干后，再加入蒸馏水得到水解样品溶液；步骤三，柱前衍生，吸取硼酸盐缓冲液‑吸取水解样品溶液‑混合‑等待2min‑吸取邻苯二甲醛衍生试剂‑混合‑吸取9‑芴甲基氯甲酸酯衍生试剂‑混合‑吸取进样溶剂‑混合；步骤四，色谱分离，进样，梯度洗脱，检测波长依次为338nm、262nm，测出峰面积；步骤五，游离氨基酸含量计算，取对照品储备液，取不同浓度进行步骤二、步骤三、步骤四，以溶液质量浓度X对峰面积Y进行线性回归，计算出线性回归方程，根据步骤四测出的峰面积，计算出各种氨基酸的含量。