[发明专利]一种脾氨肽内游离氨基酸的测定方法

权利要求书

1.一种脾氨肽内游离氨基酸的测定方法，其特征在于，包括以下步骤

步骤一，溶液配制，精密称取多种氨基酸标准品及氨基葡萄糖对照品，用HCl溶液稀释后，配制成对照品储备液；内标储备液，称取L-2氨基酸，溶于HCl溶液，配制成内标储备液；硼酸盐缓冲液，称取硼酸和氢氧化钠，溶于水后，用氢氧化钠溶液调节pH至10.2；邻苯二甲醛衍生试剂，称取邻苯二甲醛，加入硼酸盐缓冲液溶解，加入3-巯基丙酸，再用硼酸盐缓冲液稀释，超声溶解；9-芴甲基氯甲酸酯衍生试剂，称取9-芴甲基氯甲酸酯，用乙腈溶解；流动相A，磷酸氢二钠与硼酸钠缓冲液；流动相B，以体积比计，包括45份乙腈、45份甲醇、10份水；进样溶剂，包括流动相A和磷酸；

步骤二，样品处理，取脾氨肽原液，加入介孔二氧化硅微球，振荡均匀后，静置30-50分钟，介孔二氧化硅微球孔径范围在7-11nm，粒径在1.0-1.5μm之间，介孔二氧化硅微球上负载有铁粒子；超声波处理0.5-1min，频率在21000-23000HZ之间，用孔径为0.8μm的有机膜过滤；向滤液中加入内标储备液、HCl溶液，混合，真空下封口，在100℃水解24小时，冷却后开口，将水解液转移到蒸发皿，减压干燥后，加入蒸馏水，蒸干后，再加入蒸馏水得到水解样品溶液；

步骤三，柱前衍生，吸取硼酸盐缓冲液-吸取水解样品溶液-混合-等待2min-吸取邻苯二甲醛衍生试剂-混合-吸取9-芴甲基氯甲酸酯衍生试剂-混合-吸取进样溶剂-混合；

步骤四，色谱分离，进样，梯度洗脱，检测波长依次为338nm、262nm，测出峰面积；

步骤五，游离氨基酸含量计算，取对照品储备液，取不同浓度进行步骤二、步骤三、步骤四，以溶液质量浓度X对峰面积Y进行线性回归，计算出线性回归方程，根据步骤四测出的峰面积，计算出各种氨基酸的含量。

2.根据权利要求1所述的一种脾氨肽内游离氨基酸的测定方法，其特征在于：步骤一，溶液配制，

对照品储备液，每份对照品储备液配制方法如下，精密称取多种氨基酸标准品及氨基葡萄糖对照品各10mg，至10mL容量瓶，用0.1mol/LHCl稀释至刻度线，配制成1mg/mL对照品储备液；

内标储备液，每份内标储备液配制方法如下，称取10mgL-2氨基酸，置于10mL容量瓶内，用0.1mol/LHCl稀释至刻度线，配制成浓度为1mg/mL的内标储备液；

硼酸盐缓冲液，每份硼酸盐缓冲液配制方法如下，称取4.96g硼酸和2.28g氢氧化钠，加水溶解并稀释至200mL，用2mol/L氢氧化钠溶液调节pH至10.2；

邻苯二甲醛衍生试剂，每份邻苯二甲醛衍生试剂配制方法如下，称取50mg邻苯二甲醛，加入硼酸盐缓冲液溶解，加入3-巯基丙酸100μL，再用硼酸盐缓冲液稀释至10mL，超声溶解,保存于4℃；

9-芴甲基氯甲酸酯衍生试剂，每份9-芴甲基氯甲酸酯衍生试剂配制方法如下，称取9-芴甲基氯甲酸酯25mg，用乙腈溶解并稀释至10mL；

流动相A，由10mmol/L磷酸氢二钠与10mmol/L硼酸钠缓冲液；

流动相B，以体积比，包括45份乙腈、45份甲醇、10份水；

进样溶剂，每份进样溶剂，包括100mL流动相A和0.25mL磷酸。

3.根据权利要求1所述的一种脾氨肽内游离氨基酸的测定方法，其特征在于：步骤二，样品处理，取脾氨肽原液，加入介孔二氧化硅微球，介孔二氧化硅微球孔径范围在7-11nm，粒径在1.0-1.5μm之间，振荡均匀后，静置30-50分钟；超声波处理0.5-1min，频率在21000-23000HZ之间，用孔径为0.8μm的有机膜过滤；向滤液中加入内标储备液、HCl溶液，混合，真空下封口，在100℃水解24小时，冷却后开口，将水解液转移到蒸发皿，减压干燥后，加入蒸馏水，蒸干后，再加入蒸馏水得到水解样品溶液。

4.根据权利要求1所述的一种脾氨肽内游离氨基酸的测定方法，其特征在于：步骤三，柱前衍生，吸取硼酸盐缓冲液25μL-吸取水解样品溶液10μL-混合-等待2min-吸取邻苯二甲醛衍生试剂5μL-混合-吸取9-芴甲基氯甲酸酯衍生试剂4μL-混合-吸取进样溶剂320μL-混合。