[发明专利]一种脾氨肽内游离氨基酸的测定方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物制品技术领域，特别涉及一种脾氨肽内游离氨基酸的测定方法。

背景技术

脾氨肽是从动物脏器中提取出来的一种生化药，主要成分包括氨基酸、多肽、核苷酸等物质，作为免疫调节剂，用于反复呼吸道感染、支气管炎、哮喘、肺炎、癌症等病症的辅助治疗。临床观察显示，能够有效提高患者的抵抗力，减少呼吸道感染的发生率，并具有调节细胞免疫的功能，脾氨肽中主要的活性物质为多肽，国家药品标准WS1-(X-002)-2002Z中，测定多肽的含量是控制脾氨肽产品含量的唯一指标，并没有对脾氨肽内游离氨基酸含量的测定和控制。

为进一步控制脾氨肽制品的品质和稳定，已有现有技术公开了脾氨肽内游离氨基酸的测定方法，如山广志、左利民等人在中国新药杂质2013年第22卷第11期公开的文献“柱前衍生HPLC法测定脾氨肽口服液中17中游离氨基酸”，针对氨基酸分析仪测定法、离子色谱法等方法测定氨基酸时，需要价格昂贵的专用仪器，操作复杂，难以普及的缺陷，设计了柱前衍生HPLC测定脾氨肽内游离氨基酸的方法。左广志等人在文献中指出，脾氨肽口服液在色谱分离前经过各种强制条件降解破坏后，游离氨基酸含量有所增加，其他降解产物不影响各氨基酸的测定。

脾氨肽内主要成分为多肽、核苷酸、游离氨基酸，成分中以多肽稳定性较差，因此脾氨肽多经过冷冻干燥处理后以冻干粉的形式保存。但是上述游离氨基酸的测定过程中，脾氨肽口服液在强制条件降解破坏过程中，脾氨肽内的多肽容易发生降解形成氨基酸，出现左广志等人在文献中指出的现象，即在测定前游离氨基酸含量会增加，会影响测定结果的准确性。

发明内容

本发明的目的是提供一种脾氨肽内游离氨基酸的测定方法，具有准确性高的效果。

本发明的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的：一种脾氨肽内游离氨基酸的测定方法，包括以下步骤，步骤一，溶液配制，精密称取多种氨基酸标准品及氨基葡萄糖对照品，用HCl溶液稀释后，配制成对照品储备液；内标储备液，称取L-2氨基酸，溶于HCl溶液，配制成内标储备液；硼酸盐缓冲液，称取硼酸和氢氧化钠，溶于水后，用氢氧化钠溶液调节pH至10.2；邻苯二甲醛衍生试剂，称取邻苯二甲醛，加入硼酸盐缓冲液溶解，加入3-巯基丙酸，再用硼酸盐缓冲液稀释，超声溶解；9-芴甲基氯甲酸酯衍生试剂，称取9-芴甲基氯甲酸酯，用乙腈溶解；流动相A，磷酸氢二钠与硼酸钠缓冲液；流动相B，以体积比，包括45份乙腈、45份甲醇、10份水；进样溶剂，包括流动相A和磷酸；步骤二，样品处理，取脾氨肽原液，加入介孔二氧化硅微球，，振荡均匀后，静置30-50分钟，介孔二氧化硅微球孔径范围在7-11nm，粒径在1.0-1.5μm之间，介孔二氧化硅微球上负载有铁粒子；超声波处理0.5-1min，频率在21000-23000HZ之间，用孔径为0.8μm的有机膜过滤；向滤液中加入内标储备液、HCl溶液，混合，真空下封口，在100℃水解24小时，冷却后开口，将水解液转移到蒸发皿，减压干燥后，加入蒸馏水，蒸干后，再加入蒸馏水得到水解样品溶液；步骤三，柱前衍生，吸取硼酸盐缓冲液-吸取水解样品溶液-混合-等待2min-吸取邻苯二甲醛衍生试剂-混合-吸取9-芴甲基氯甲酸酯衍生试剂-混合-吸取进样溶剂-混合；步骤四，色谱分离，进样，梯度洗脱，检测波长依次为338nm、262nm，测出峰面积；步骤五，游离氨基酸含量计算，取对照品储备液，取不同浓度进行步骤二、步骤三、步骤四，以溶液质量浓度X对峰面积Y进行线性回归，计算出线性回归方程，根据步骤四测出的峰面积，计算出各种氨基酸的含量。