[发明专利]一种梨S7-RNase蛋白的体外表达方法及其多克隆抗体的制备方法

摘要

本发明公布了一种梨S7‑RNase蛋白的体外表达及其多克隆抗体的制备方法。通过设计引物克隆梨S7‑RNase基因；构建大肠杆菌重组表达载体S7‑cutSignalP‑pCold‑TF；将构建的重组表达载体S7‑cutSignalP‑pCold‑TF转化到大肠杆菌Rosetta(DE3)中，构建表达梨S7‑RNase蛋白的重组菌株；对重组菌株进行表达，并用镍柱亲和层析发纯化重组梨S7‑RNase蛋白；以纯化的重组梨S7‑RNase蛋白为抗原，采用常规多克隆抗体制备方法制备梨S7‑RNase多克隆抗体。通过本发明的方法，实现了梨S7‑RNase蛋白的体外表达并制备出了效价高、特异性好的梨S7‑RNase多克隆抗体，完全可以满足相关实验的需求。 1

主权项

1.一种梨S₇‑RNase蛋白体外表达的方法，其特征在于，包括以下步骤：

a.提取梨花柱总RNA，反转录成cDNA，设计引物PCR扩增梨S₇‑RNase基因；

b.构建表达梨S₇‑RNase蛋白的原核重组表达载体；

c.将步骤b构建的原核重组表达载体转化到大肠杆菌菌株Rosetta(DE3)中，构建S₇‑RNase重组表达菌株；

d.培养步骤c所构建的S₇‑RNase重组表达菌株至OD₆₀₀达到0.4‑0.6，并低温处理后，加入诱导剂IPTG，诱导表达梨S₇‑RNase蛋白；

e.纯化诱导表达的梨S₇‑RNase蛋白。

2.根据权利要求1所述的梨S₇‑RNase蛋白体外表达的方法，其特征在于，步骤a中，用于PCR扩增梨S₇‑RNase基因的正向引物为5’‑CCGCTCGAGATGTACGATTATTTTCAATTTACGCAGC‑3’，反向引物为5’‑CTAGTCTAGAATACTTAACATCGGCCGGGC‑3’。

3.根据权利要求1或2所述的梨S₇‑RNase蛋白体外表达的方法，其特征在于，步骤a中，PCR扩增梨S₇‑RNase基因的PCR反应体系为：ddH₂O 33μl，上下游引物各1.5μl,cDNA 1μl,10×KOD‑Plus‑PCR buffer 5μl,2mM dNTPs 5μl,25mM MgSO₄ 2μl,KOD‑Plus‑DNA polymerase 1μl；PCR反应条件为：94℃预变性2min，然后进行94℃15s，60℃30s，68℃1min，共30个循环，最后68℃延伸10min。

4.根据权利要求1所述的梨S₇‑RNase蛋白体外表达的方法，其特征在于，步骤b中，构建表达梨S₇‑RNase蛋白的原核重组表达载体时，所使用的原核表达载体为大肠杆菌表达载体pCold‑TF，克隆梨S₇‑RNase基因的插入位点为Xho I和Xba I酶切位点之间。

5.根据权利要求4所述的梨S₇‑RNase蛋白体外表达的方法，其特征在于，PCR产物经1％的琼脂糖凝胶电泳分析并切胶回收，回收产物用Xho I和Xba I限制性内切酶双酶切后连接到经同样双酶切的大肠杆菌表达载体pCold‑TF的Xho I和Xba I位点上。

6.根据权利要求1所述的梨S₇‑RNase蛋白体外表达的方法，其特征在于，步骤d中，所述的低温处理为置于冰上5‑10min，然后15‑18℃静置40‑60分钟，所述诱导剂IPTG的终浓度为0.5‑1.0mmol/L，所述诱导表达的条件为15‑18℃诱导18‑24小时。

7.根据权利要求1或6所述的梨S₇‑RNase蛋白体外表达的方法，其特征在于，步骤d中诱导表达梨S₇‑RNase蛋白的详细过程为：将构建的S₇‑RNase重组表达菌株按照1:50的比例接种到100ml含100μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃、200～250rpm震荡培养过夜，然后按1:50的比例转接到300ml含100μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃、200～250rpm震荡培养至菌液OD₆₀₀达到0.4‑0.6，迅速置于冰上5‑10分钟，然后15‑18℃静置40‑60分钟；然后加入终浓度为0.5‑1.0mmol/L的诱导剂IPTG，15～18℃、200～250rpm震荡培养,诱导表达18‑24小时；

步骤e中纯化诱导表达的梨S₇‑RNase蛋白的详细过程为：诱导表达完成后，于4℃下12000rpm离心10分钟后弃上清，收集沉淀，向沉淀中加入裂解液重悬沉淀；重悬后菌液使用超声破碎，超声破碎完成后，12000rpm离心15分钟，收集上清，上清经0.45μm滤膜过滤后，使用镍柱亲和层析法对梨S₇‑RNase蛋白进行纯化，使用镍柱亲和层析介质纯化蛋白前，需用10倍柱体积的平衡缓冲液来平衡层析介质；收集纯化蛋白，使用截流量为30kDa的超滤管在4℃下6000rpm转速下进行浓缩、脱盐,最后放入‑80℃保存备用；

所述裂解液的配方为：140mM氯化钠，2.7mM氯化钾，10mM磷酸氢二钠，1.8mM磷酸二氢钾，50×EDTA‑free protease inhibitor cocktail III，pH为7.3；

所述平衡缓冲液的配方为：500mM氯化钠，20mM三(羟甲基)氨基甲烷，5mM咪唑，pH为7.3。

8.根据权利要求1所述的梨S₇‑RNase蛋白体外表达的方法，其特征在于，所述梨S₇‑RNase蛋白N端带有6个组氨酸标签。

9.权利要求1‑8所述的方法制备的重组梨S₇‑RNase蛋白作为抗原在制备梨S₇‑RNase多克隆抗体中的应用。

10.一种梨S₇‑RNase多克隆抗体的制备方法，其特征在于：将权利要求1‑8所述的方法制得的重组梨S₇‑RNase蛋白作为抗原免疫日本大耳白兔，第一次免疫采用重组梨S₇‑RNase蛋白与等体积的弗氏完全佐剂乳化后注射实验兔，3周后用重组梨S₇‑RNase蛋白与等体积的弗氏不完全佐剂乳化后第二次免疫实验兔，之后每两周进行1次加强免疫，总共4次免疫，最后一次免疫7天后采血，收集抗血清。